八肋游仆虫无义mRNA识别和降解因子的细胞定位分析

发布时间：2022-12-03 19:29

　　在真核生物细胞中,mRNA的降解是基因表达的一个重要过程,它决定了mRNA在细胞质中的丰度。无义介导的mRNA降解途径（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）就是一种耦联翻译的mRNA降解机制,它可以识别和降解含有提前终止密码子（premature termination codons,PTCs）的异常转录本,从而避免潜在毒性截短型蛋白质的表达。NMD途径可以有效监控mRNA的质量,保障基因精准表达。尽管对NMD途径机制的研究在哺乳动物、果蝇和酵母等后生动物细胞中取得了一些进展,但关于无义mRNA的识别和降解机制仍然没有被清楚的阐释,还存在诸多争议。原生动物作为一类单细胞真核生物,其NMD途径机制得到了一些初步研究,但是相关的研究报道相对于后生动物比较匮乏。由于其进化上的特殊性和细胞结构的简洁性,对原生动物NMD途径的研究有助于阐明真核生物NMD途径的进化和分子机制。本文在对原生动物八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）细胞中无义mRNA识别和降解过程中的关键因子进行生物信息学鉴定的基础上,利用含有荧光蛋白基因的大核人工染色体,对这些关键... 

【文章页数】：97 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 mRNA质量监控机制
    1.2 NMD途径作用的底物
    1.3 参与NMD途径的因子
        1.3.1 UPF蛋白
        1.3.2 外显子连接复合体
        1.3.3 SMG1 复合体
        1.3.4 无义mRNA降解相关因子
    1.4 各种生物的NMD途径模型
        1.4.1 酿酒酵母NMD途径模型
        1.4.2 蓝氏贾第虫NMD途径模型
        1.4.3 嗜热四膜虫NMD模型
        1.4.4 哺乳动物NMD模型
    1.5 八肋游仆虫
    1.6 本研究的目的与意义
    1.7 本研究的创新性
第二章 八肋游仆虫NMD途径因子的生物信息学分析
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 实验主要试剂
        2.2.3 实验试剂的配制
        2.2.4 生物信息学分析
        2.2.5 重组表达质粒的缺失突变
        2.2.6 蛋白质体外表达与Pull-down分析
    2.3 实验结果
        2.3.1 八肋游仆虫NMD途径相关因子的鉴定
        2.3.2 eUPF1与e UPF2 蛋白质三级结构预测及蛋白分子对接
        2.3.3 αA-helixe(UPF2-U1BD)结构在e UPF1-eUPF2 复合体中的作用
    2.4 讨论
第三章 八肋游仆虫NMD通路上游因子的细胞共定位研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 菌株、质粒与八肋游仆虫大核人工染色体
        3.2.2 主要实验试剂与引物
        3.2.3 试剂配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 八肋游仆虫总RNA提取及合成c DNA的方法
        3.3.2 重组载体构建
        3.3.3 脂质体转染
    3.4 实验结果
        3.4.1 含mCherry基因的八肋游仆大核人工染色体的构建
        3.4.2 八肋游仆虫大核人工染色体表达验证
        3.4.3 NMD通路上游因子相关重组质粒构建
        3.4.4 核心因子UPF1与UPF2 之间的细胞定位关系
        3.4.5 EJC组分因子与UPF2 之间的共定位关系
        3.4.6 PABP在八肋游仆虫细胞中的定位
    3.5 讨论
第四章 八肋游仆虫NMD途径下游降解因子共定位及途径发生的初步探究
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 菌株和质粒
        4.2.2 实验主要试剂
        4.2.3 试剂的配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 重组表达载体的构建
        4.3.2 免疫荧光定位
        4.3.3 重组质粒定点无义突变
    4.4 实验结果
        4.4.1 NMD通路下游因子相关重组质粒构建
        4.4.2 人类同源DCP2 抗体能与八肋游仆虫DCP2 蛋白质特异结合
        4.4.3 P-body组分因子和外切体分别与UPF1 的共定位关系
        4.4.4 八肋游仆虫NMD途径发生的初步探究
    4.5 讨论
总结与展望
参考文献
附录1
附录2
附录3
攻读硕士期间取得的研究成果
致谢
个人简介及联系方式


【参考文献】：
期刊论文
[1]蓝氏贾第虫无义mRNA的降解[J]. 吕佳,柴杨丽,周宝春,柴宝峰.  中国生物化学与分子生物学报. 2019(02)
[2]UPF2介导八肋游仆虫NMD途径SURF和EJC的耦联[J]. 柴杨丽,吕佳,周宝春,梁爱华,柴宝峰.  山西大学学报(自然科学版). 2019(03)
[3]八肋游仆虫NMD通路的初步研究[J]. 石文鑫,王美,柴杨丽,吕佳,张志云,王刚,柴宝峰.  中国细胞生物学学报. 2018(06)
[4]SMG1-UPF1-eRF1-eRF3复合体参与贾第虫无义介导的mRNA降解激活[J]. 王美,吕佳,石文鑫,柴杨丽,文建凡,张西臣,柴宝峰.  中国生物化学与分子生物学报. 2018(05)
[5]无义mRNA降解途径的机制与进化[J]. 柴宝峰,王美,石文鑫,柴杨丽,吕佳.  山西大学学报(自然科学版). 2017(03)
[6]肽链释放因子和核糖体蛋白L11在八肋游仆虫细胞中的定位[J]. 柴宝峰,李娜,王景涛,申泉,张志云,梁爱华.  生物工程学报. 2010(02)
[7]八肋游仆虫含绿色荧光蛋白基因的大核人工染色体的构建[J]. 李娜,柴宝峰,王景涛,梁爱华.  中国生物化学与分子生物学报. 2009(05)
[8]P-body及其与mRNA的转录后调节之间的关系[J]. 张义玲,郭艳合,王毅刚,刘立,钱程.  中国生物化学与分子生物学报. 2008(08)



本文编号：3706837