新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶基因克隆表达及活性评价
发布时间：2022-12-04 01:32
生物粘合剂具有良好的生物相容性和可降解性,可以替代传统的缝合技术,在生物医药领域已被受到广泛关注。新月柄杆菌（Caulobacter crescentus CB15）能分泌迄今为止粘附能力最强的水下天然粘性物质-holdfast,其合成和分泌途径是一个复杂的过程,其中hfsH基因编码的多糖脱乙酰化酶是影响粘性的关键因素。因此,本论文以新月柄杆菌hfsH基因为研究对象,对其密码子进行优化及生物信息学分析,并进行了克隆和可溶性表达,在利用镍柱亲和层析分析纯化重组酶的基础上,对其生物学活性进行了初步评价。主要研究内容有以下几部分:第一部分:新月柄杆菌hfsH基因分析及载体构建。对hfsH基因的原始序列进行密码子优化,并利用RNAfold在线软件对优化前后hfsH基因序列的5′和3′端mRNA二级结构的自由能及GC含量进行分析。结果发现,优化后的序列自由能降低,GC含量从71%降至67%,更利于后期表达。生物信息学分析表明,有5个相对保守的氨基酸功能域分别是Motif 1（T（F/Y）DD）、Motif 2（H（S/T）xxH）、Motif 3（RxPY）、Motif 4(DxxD（W/Y）及...
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
术语与缩略语表
第一章 绪论
1.1 生物粘合剂
1.2 源于新月柄杆菌的超高粘附物质holdfast概述
1.2.1 新月柄杆菌
1.2.2 新月柄杆菌分泌物-holdfast
1.2.3 Holdfast的化学结构
1.2.4 Holdfast的生物合成
1.3 多糖脱乙酰化酶的研究现状
1.3.1 多糖脱乙酰化酶概述
1.3.2 来源与分类
1.3.3 多糖脱乙酰化酶的结构特点
1.3.4 多糖脱乙酰化酶的底物类型及特征
1.3.5 多糖脱乙酰化酶的催化机制
1.3.6 多糖脱乙酰化酶的应用前景
1.4 研究目的及意义
第二章 新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶基因的生物信息学分析及载体构建
2.1 实验材料
2.1.1 菌种与载体
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器
2.1.4 培养基的配制
2.1.5 标准溶液的配制
2.2 实验方法
2.2.1 新月柄杆菌hfsH基因功能的生物信息学分析
2.2.2 新柄杆菌hfsH基因的序列优化
2.2.3 新月柄杆菌hfsH基因克隆
2.2.4 PCR产物的回收
2.2.5 pET-28a(+)-hfsH重组表达载体构建流程
2.2.6 PCR回收产物和pET-28a(+)载体的双酶切
2.2.7 连接
2.2.8 转化
2.2.9 pET-28a(+)-hfsH重组质粒提取
2.2.10 pET-28a(+)-hfsH重组质粒酶切鉴定
2.2.11 pET-28a(+)-hfsH重组质粒测序及菌种保藏
2.3 实验结果与分析
2.3.1 生物信息学分析
2.3.2 hfsH基因序列的优化及分析
2.3.3 PCR扩增产物及分析
2.3.4 酶切电泳检测结果及分析
2.3.5 pET-28a(+)-hfsH重组质粒酶切鉴定结果及分析
2.3.6 pET-28a(+)-hfsH重组质粒序列测定结果及分析
2.4 讨论
第三章 新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶基因的表达及重组蛋白纯化
3.1 实验材料
3.1.1 菌种和质粒
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器
3.1.4 标准溶液的配制
3.2 实验方法
3.2.1 新月柄杆菌hfsH基因诱导表达
3.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳检测
3.2.3 诱导表达条件的优化
3.2.4 重组HfsH蛋白纯化
3.2.5 蛋白浓度的测定
3.2.6 N端测序鉴定
3.3 实验结果与分析
3.3.1 大肠杆菌生长曲线
3.3.2 hfsH基因表达及条件优化结果
3.3.3 重组HfsH蛋白的纯化结果
3.3.4 重组HfsH蛋白N端测序鉴定
3.3.5 重组HfsH蛋白浓度的测定
3.4 讨论
第四章 新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶的活性分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验试剂
4.1.2 实验仪器
4.1.3 标准溶液的配制
4.2 实验方法
4.2.1 酶活方法的建立
4.2.2 重组HfsH最适温度的测定
4.2.3 重组HfsH最适pH的测定
4.3 实验结果及分析
4.3.1 标准曲线绘制
4.3.2 活性测定结果
4.3.3 酶浓度对酶活性的影响
4.3.4 最适反应温度及分析
4.3.5 最适反应pH及分析
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
攻读硕士期间取得的科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组Trail蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化条件的优化[J]. 蔡媛媛,李雪燕,吴玉,杜晶春,徐霞. 细胞与分子免疫学杂志. 2012(06)
[2]塞内昔布抑制兔脉络膜新生血管的形成[J]. 乔岗,周希瑗,邓鑫,李琳. 眼视光学杂志. 2005(04)
本文编号：3707354
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
术语与缩略语表
第一章 绪论
1.1 生物粘合剂
1.2 源于新月柄杆菌的超高粘附物质holdfast概述
1.2.1 新月柄杆菌
1.2.2 新月柄杆菌分泌物-holdfast
1.2.3 Holdfast的化学结构
1.2.4 Holdfast的生物合成
1.3 多糖脱乙酰化酶的研究现状
1.3.1 多糖脱乙酰化酶概述
1.3.2 来源与分类
1.3.3 多糖脱乙酰化酶的结构特点
1.3.4 多糖脱乙酰化酶的底物类型及特征
1.3.5 多糖脱乙酰化酶的催化机制
1.3.6 多糖脱乙酰化酶的应用前景
1.4 研究目的及意义
第二章 新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶基因的生物信息学分析及载体构建
2.1 实验材料
2.1.1 菌种与载体
2.1.2 实验试剂
2.1.3 实验仪器
2.1.4 培养基的配制
2.1.5 标准溶液的配制
2.2 实验方法
2.2.1 新月柄杆菌hfsH基因功能的生物信息学分析
2.2.2 新柄杆菌hfsH基因的序列优化
2.2.3 新月柄杆菌hfsH基因克隆
2.2.4 PCR产物的回收
2.2.5 pET-28a(+)-hfsH重组表达载体构建流程
2.2.6 PCR回收产物和pET-28a(+)载体的双酶切
2.2.7 连接
2.2.8 转化
2.2.9 pET-28a(+)-hfsH重组质粒提取
2.2.10 pET-28a(+)-hfsH重组质粒酶切鉴定
2.2.11 pET-28a(+)-hfsH重组质粒测序及菌种保藏
2.3 实验结果与分析
2.3.1 生物信息学分析
2.3.2 hfsH基因序列的优化及分析
2.3.3 PCR扩增产物及分析
2.3.4 酶切电泳检测结果及分析
2.3.5 pET-28a(+)-hfsH重组质粒酶切鉴定结果及分析
2.3.6 pET-28a(+)-hfsH重组质粒序列测定结果及分析
2.4 讨论
第三章 新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶基因的表达及重组蛋白纯化
3.1 实验材料
3.1.1 菌种和质粒
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器
3.1.4 标准溶液的配制
3.2 实验方法
3.2.1 新月柄杆菌hfsH基因诱导表达
3.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳检测
3.2.3 诱导表达条件的优化
3.2.4 重组HfsH蛋白纯化
3.2.5 蛋白浓度的测定
3.2.6 N端测序鉴定
3.3 实验结果与分析
3.3.1 大肠杆菌生长曲线
3.3.2 hfsH基因表达及条件优化结果
3.3.3 重组HfsH蛋白的纯化结果
3.3.4 重组HfsH蛋白N端测序鉴定
3.3.5 重组HfsH蛋白浓度的测定
3.4 讨论
第四章 新月柄杆菌多糖脱乙酰化酶的活性分析
4.1 实验材料
4.1.1 实验试剂
4.1.2 实验仪器
4.1.3 标准溶液的配制
4.2 实验方法
4.2.1 酶活方法的建立
4.2.2 重组HfsH最适温度的测定
4.2.3 重组HfsH最适pH的测定
4.3 实验结果及分析
4.3.1 标准曲线绘制
4.3.2 活性测定结果
4.3.3 酶浓度对酶活性的影响
4.3.4 最适反应温度及分析
4.3.5 最适反应pH及分析
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
攻读硕士期间取得的科研成果
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组Trail蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化条件的优化[J]. 蔡媛媛,李雪燕,吴玉,杜晶春,徐霞. 细胞与分子免疫学杂志. 2012(06)
[2]塞内昔布抑制兔脉络膜新生血管的形成[J]. 乔岗,周希瑗,邓鑫,李琳. 眼视光学杂志. 2005(04)
本文编号：3707354
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/3707354.html
