猪GPIHBP1基因启动子功能研究

发布时间：2017-05-20 01:06

  本文关键词：猪GPIHBP1基因启动子功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脂蛋白酶(Lipoprotein lipase, LPL)在脂质的代谢与转运过程中起着重要的作用。LPL通过与脂蛋白相互作用,将脂蛋白锚定到血管壁,以促进脂蛋白颗粒的吸收,且LPL通过水解富含甘油三酯的脂蛋白还可以为重要组织提供脂质营养素。糖基化磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1 (Glycosylphosphatidylinositol-anchored high density lipoprotein-binding protein 1, GPIHBP1)作为LPL重要的调控因子,其功能是既可以与LPL结合作为脂肪分解的平台,又可以作为LPL的载体参与其向毛细血管内皮细胞的转运。但GPIHBP1基因转录调控机理国内外迄今未见报道,因此,GPIHBP1基因启动子功能至今也未见研究。本研究拟通过对猪GPIHBP1基因启动子转录活性的初步研究,找到核心启动子区和启动子区的主要转录因子；通过对启动子区单核苷酸多态性的分析,找到与猪脂肪性状有关的多态位点。文章运用生物信息学、分子生物学、细胞学等实验方法对猪GPIHBP1基因启动子功能进行了研究,取得结果如下：1.获得了猪GPIHBP1基因5’端启动子区全长2232 bp的DNA序列,并成功构建了猪GPIHBP1基因不同启动子片段的重组载体：pGL3-95、pGL3-288、pGL3-490、 pGL3-1000、pGL3-1299、pGL3-1966。2.将构建好的不同启动子片段的载体分别转染PK15细胞,利用双荧光素酶报告基因系统对启动子活性进行分析发现：-490—+265区间的活性最强,预测是核心启动子所在区间；-95—+265区间具有基本启动子功能,推测这与SOX-9转录因子结合元件有关；在-95—-490和-1229—-1996区间存在正调控,推测这与STER、ADR1与c-ets-1等转录因子结合元件有关；-490—-1227区间存在负调,推测这与MyoD、HSF和Barbie Box转录因子结合元件有关。3.采用PCR产物直接测序法,对6个品种(藏猪、雅南猪、金华猪、凉山猪、长白猪和杜洛克猪)共56头个体的GPIHBP1基因启动子区序列进行直接测序。共筛选出11个SNPs位点,这些位点均位于转录起始位点上游,其中-903 GC位点能被Sma Ⅰ限制酶识别。4.为进一步分析这些多态位点是否影响猪机体的脂肪代谢,我们在56头猪群体中,对GPIHBP1基因启动子区出现的11个SNPs与背膘厚进行了关联分析,结果发现-703 GA位点与背膘厚存在显著相关性(P0.05),此位点基因型分布在6个群体中存在极显著差异(P0.01)。
【关键词】：猪 GPIHBP1基因 启动子活性 SNPs
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;S828
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 文献综述10-21
• 1 GPIHBP1基因研究进展11-16
• 1.1 GPIHBP1基因发现与功能11-12
• 1.2 GPIHBP1的结构12-13
• 1.3 GPIHBP1基因的表达13-14
• 1.4 GPIHBP1与高乳糜微粒血症14-15
• 1.5 猪GPIHBP1研究现状15-16
• 2 启动子概述16-20
• 2.1 RNA聚合酶Ⅱ启动子16-17
• 2.3 RNA聚合酶Ⅱ启动子的分类与特点17-18
• 2.4 启动子区的CpG岛与DAN甲基化18-20
• 3 本研究的目的及意义20-21
• 第二章 猪GPIHBP1基因启动子活性初步分析21-47
• 1 试验材料21-26
• 1.1 DNA样品21
• 1.2 主要仪器和设备21-22
• 1.3 试验主要试剂22-23
• 1.4 质粒、菌种和细胞23-24
• 1.5 生物信息学分析软及参考数据库24-26
• 2 试验方法26-35
• 2.1 基因组DNA的提取与检测26-27
• 2.2 猪GPIHBP1基因启动子5’侧翼缺失片段的设计27
• 2.3 用于构建猪GPIHBP1基因5’侧翼启动子缺失载体的引物设计27-28
• 2.4 猪GPIHBP1基因5’侧翼启动子缺失载体第一部分的构建28-30
• 2.5 猪GPIHBP1基因5’侧翼启动子缺失载体第二部分的构建30-31
• 2.6 去内毒素质粒小量提取31-32
• 2.7 细胞培养32-33
• 2.8 细胞转染33-34
• 2.9 双荧光素酶活性的检测34
• 2.10 数据统计与分析34-35
• 3 结果与分析35-43
• 3.1 基因组DNA的提取与检测35
• 3.2 猪GPIHBP1基因启动子区的生物信息学分析35-36
• 3.3 猪GPIHBP1基因启动子目的片段的获得36
• 3.4 猪GPIHBP1基因启动子重组载体的构建载36-41
• 3.5 GPIHBP1启动子不同片段重组载体荧光素酶活性分析41-43
• 4 讨论43-47
• 4.1 猪、人、小鼠GPIHBP1基因启动子区结构比较43-44
• 4.2 猪GPIHBP1基因5’侧翼启动子活性及转录因子分析44-47
• 第三章 猪GPIHBP1基因启动子区单核苷多态性研究47-55
• 1 引言47
• 2 试验材料47
• 2.1 试验猪群及表型数据47
• 2.2 主要试剂47
• 3 试验方法47-49
• 3.1 GPIHBP1基因启动子区SNPs的检测与分型47-48
• 3.2 数据统计与分析48-49
• 4 结果与分析49-54
• 4.1 猪GPIHBP1基因启动子区SNP筛选结果49-52
• 4.2 猪GPIHBP1基因启动子SNPs遗传效应分析52-54
• 5 讨论54-55
• 第四章 结论55-56
• 参考文献56-61
• 致谢61-62
• 附录62-63
• 硕士在读期间发表的论文63

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本文编号：380328