七鳃鳗Syk的克隆表达、生物信息学分析及相关免疫学研究

发布时间：2024-02-22 00:35

　　Syk(spleen tyrosine kinase)是非受体型酪氨酸激酶家族成员之一。在脊椎动物中,Syk是B细胞受体信号通路的主成部分,也能调节B淋巴细胞的许多生理功能。通过七鳃鳗血液数据库中搜索Syk基因的EST序列,找到一条有效序列,将得到的序列与海七鳃鳗数据库比对,确定了Syk基因的序列。通过3’RACE扩增实验以及开放阅读框高保真酶扩增,成功得到了七鳃鳗Syk基因全长序列。通过不同物种的Syk氨基酸序列比对,构建系统发育树,分析Syk不同物种的亲源关系。此外,还对Syk基因进行结构预测,通过MEME在线软件对保守基序预测以及抗原表位预测。利用Real-time PCR检测法,分析对照组和混合菌刺激组的相对表达量,结果显示在未用混合菌刺激时,Syk在七鳃鳗组织中广泛表达,当混合菌刺激后,Syk的表达量都有所上调,其中在鳃、白细胞、肾和心的表达量明显上调,在髓样小体中的表达量也有上调趋势。进一步通过Western Blot检测,以β-actin为内参,在未刺激时,Syk在鳃、髓样小体和白细胞中表达,经过混合菌刺激后,Syk在髓样小体和白细胞中表达量明显上调,以上均有统计学意义。...

【文章页数】：96 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 Syk分子的结构特点
        1.1.1 TyrKc结构域和SH2结构域
        1.1.2 功能域A和功能域B
        1.1.3 激酶结构域的自动抑制作用
    1.2 Syk的激活调节模式
        1.2.1 Syk与磷酸化的ITAM的相互作用
        1.2.2 Syk的翻译后修饰
        1.2.3 Syk的酪氨酸残基磷酸化作用
    1.3 在病原体识别中Syk的作用
        1.3.1 真菌的识别
        1.3.2 炎症激活的作用
    1.4 Syk其他的免疫功能
    1.5 Syk的非免疫功能
    1.6 结语
第2章 七鳃鳗Syk的分子克隆及生物信息学分析
    2.1 七鳃鳗Syk的分子克隆
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
        2.1.3 结果
    2.2 Syk编码氨基酸序列的生物信息学分析
        2.2.1 分析所用的在线网站和软件
        2.2.2 结果
    2.3 讨论
    2.4 小结
第3章 七鳃鳗Syk基因表达与纯化
    3.1 实时荧光定量PCR法检测七鳃鳗Syk在各组织中相对表达量
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
        3.1.3 结果
    3.2 重组Syk载体的构建和原核表达
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
        3.2.3 结果
    3.3 讨论
    3.4 小结
第4章 七鳃鳗Syk重组蛋白抗体制备及其鉴定
    4.1 多克隆抗体制备：
    4.2 Western Blot鉴定多克隆抗体的特异性
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
    4.3 结果
        4.3.1 制备多克隆抗体
        4.3.2 Syk多克隆抗体的特异性检测
    4.4 讨论
    4.5 小结
第5章 七鳃鳗Syk蛋白的鉴定
    5.1 材料
    5.2 方法
        5.2.1 混合菌刺激七鳃鳗
        5.2.2 白细胞的分离及组织提取
        5.2.3 白细胞及组织总蛋白的提取
        5.2.4 Western blot分析Syk蛋白的表达情况
        5.2.5 免疫沉淀分析可能与Syk相互作用的蛋白
        5.2.6 免疫荧光分析Syk在白细胞中的定位
    5.3 结果
        5.3.1 白细胞以及组织总蛋白的浓度
        5.3.2 Syk在七鳃鳗不同组织蛋白中的相对表达量
        5.3.3 Syk蛋白的免疫沉淀及其质谱鉴定
        5.3.4 免疫荧光分析Syk蛋白在白细胞中的定位
    5.4 讨论
    5.5 小结
结论
本论文创新点
参考文献
附录A 七鳃鳗Syk mRNA全序列
附录B 不同物种的Syk的FASTA格式氨基酸序列
附录C pET-32a质粒图谱
附录D 蛋白质浓度测定标准曲线
附录E 免疫沉淀质谱图
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢



本文编号：3906126