基于转录组分析和基因编辑技术对高表达植酸酶毕赤酵母MAPK信号通路作用的初步研究

发布时间：2024-09-17 16:32

　　巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii syn.Pichia pastoris）作为目前重要的外源蛋白表达宿主菌之一,已经在工业生产当中得到广泛应用。在分子生物学研究中,对于基因功能的探索是揭示生命奥秘的关键,如何能够有效的探究基因的功能显得极其重要。目前,对于该菌株发酵过程中相关基因的表达与菌株代谢规律了解甚少,特别是有关信号传导通路对蛋白质诱导表达过程中的作用。正因为缺乏对细胞信号转导通路的认知,发酵过程缺乏有效的调节与控制,外源蛋白的表达量也有待进一步的提高。基于此现状,本文首先利用实验室构建的高表达植酸酶的毕赤酵母基因工程菌株K.phaffii GS115/pPIC9K-PhyA为出发菌株,在10,000 L发酵罐进行了发酵研究,利用RNA-Seq技术分别对菌株在批量发酵阶段、甘油流加阶段、甘油-甲醇混合进料阶段以及在甲醇诱导阶段的不同时期进行基因表达的研究:结果表明显著上调的基因数主要发生在促分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPK）信号通路、过氧化物酶体、甲醇代谢、淀粉和蔗糖代谢、自噬、线粒体吞噬和减...

【文章页数】：128 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
术语及符号说明
第1章 绪论
    1.1 毕赤酵母表达系统
        1.1.1 毕赤酵母表达系统的研究现状
        1.1.2 毕赤酵母表达系统的优点及不足
    1.2 利用RNA-Seq技术的转录组学研究
        1.2.1 转录组学基本概述
        1.2.2 转录组在毕赤酵母中的研究进展
    1.3 CRISPR技术及发展
        1.3.1 CRISPR技术的基本原理
        1.3.2 Cas9 蛋白和sgRNA
    1.4 MAPK信号通路
        1.4.1 激酶:一种细胞信号传递机制
        1.4.2 MAPK激酶级联反应
        1.4.3 MAPK信号转导途径
    1.5 本课题的研究背景及意义
    1.6 研究内容
    1.7 技术路线
第2章 高表达植酸酶毕赤酵母GS115的转录组学分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株和质粒
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 常用溶液和常用培养基培养基的配置
    2.2 实验方法
        2.2.1 发酵过程及条件
        2.2.2 RNA-Seq样品制备
        2.2.3 RNA定量和鉴定
        2.2.4 转录组测序的文库制备
        2.2.5 质量控制
        2.2.6 Read映射到参考基因组
        2.2.7 差异表达分析
        2.2.8 差异表达基因的KEGG富集分析
        2.2.9 酶活测定
    2.3 结果
        2.3.1 补料分批发酵系统探讨诱导巴斯德毕赤酵母植酸酶的异源表达
        2.3.2 转录组数据总体分析
        2.3.3 毕赤酵母代谢途径相关基因的转录组学分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第3章 CRISPR/Cas9 基因编辑系统在毕赤酵母中的构建及研究
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验菌株及质粒
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 常用培养基
        3.1.5 引物合成,基因测序及基因合成
    3.2 实验方法
        3.2.1 荧光蛋白mCherry报告系统的建立
            3.2.1.1 荧光蛋白mCherry真核表达载体的构建
            3.2.1.2 重组荧光蛋白mCherry在毕赤酵母中的高效表达
            3.2.1.3 重组荧光蛋白mCherry的荧光检测
        3.2.2 毕赤酵母基因编辑系统pGAP-spCas9-sgRNA的构建及应用
        3.2.3 毕赤酵母基因编辑系统pHTX-hsCas9-sgRNA-Z的构建及应用
    3.3 结果与分析
        3.3.1 荧光蛋白m Cherry报告系统的建立
        3.3.2 毕赤酵母基因编辑系统pGAP-spCas9-sgRNA的构建及应用
        3.3.3 毕赤酵母基因编辑系统pHTX-hsCas9-sgRNA-Z及应用
    3.4 讨论
    3.5 本章小节
第4章 毕赤酵母MAPK通路上调基因的缺失及表型研究
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验菌株及质粒
        4.1.2 主要仪器
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 常用培养基
        4.1.5 引物合成及基因测序
    4.2 实验方法
        4.2.1 毕赤酵母MAPK通路上调基因敲除质粒的构建
        4.2.2 毕赤酵母感受态细胞GS115的制备及转化
        4.2.3 毕赤酵母基因组的提取
        4.2.4 基因敲除结果的验证
        4.2.5 植酸酶的测定
    4.3 实验结果
        4.3.1 毕赤酵母MAPK通路上调基因分析
        4.3.2 毕赤酵母MAPK通路上调基因敲除靶点的选择及敲除质粒的构建
        4.3.3 毕赤酵母MAPK通路上调基因缺失菌株的构建
        4.3.4 基因敲除菌株的生长曲线
        4.3.5 基因敲除菌株在PAOX1调控下植酸酶的表达情况
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第5章 总结与展望
    5.1 总结
        5.1.1 高表达植酸酶毕赤酵母的转录组分析
        5.1.2 CRISPR/Cas9 基因编辑系统在毕赤酵母中的构建及研究
        5.1.3 毕赤酵母MAPK通路上调基因的缺失及表型研究
    5.2 创新
    5.3 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文和研究成果
附录
    附录 A 实验中所使用的缓冲液的配制
    附录 B 本文所涉及到的氨基酸序列
    附录 C 本文所涉及到的核苷酸序列
    附录 D 氨基酸中英文对照及缩写表



本文编号：4005728