CRISPR/Cas9介导绿色荧光蛋白基因在牛NANOG位点定点整合的研究

发布时间：2025-01-01 01:06

　　Nanog是一种在内细胞团、原始生殖细胞以及ESCs表达的新转录因子。属于ANTP类,NK家族基因。在胚胎发育及干细胞分化中有着重要作用。本研究针对牛的NANOG基因的一段序列设计特异识别的gRNA并构建了 CRISPR/Cas9表达载体。实验选用的骨架载体具有新霉素抗性基因(Neor)表达框架和报告基因EGFP,构建了针对CRISPR/Cas9切割位点的同源打靶载体pNlrkt。其外源基因为EGFP,在报告基因的上游包含长801bp的5'同源臂,在(Neor)表达框架下游包含长370bp的3'同源臂。限制性酶切片段分析和序列测定分析的结果表明,所构建的pNlrkt载体正确。将构建成功的载体pNlrkt用脂质体转染方法导入到人胚胎干细胞MelI细胞系中,经24h培养后,荧光显微镜下观察到绿色荧光,结果表明pNlrkt载体可指导EGFP使其在人胚胎干细胞中发光。为了获得EGFP基因在NANOG基因位点定点整合的细胞系,检测CRISPR/Cas9介导的外源基因整合效率,通过电转染的方法将CRISPR/Cas9:pNlrkt导入到秦川牛胎儿成纤维细胞中,经过G418筛选、口吸管和流式细胞仪挑单...

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１－２双酶切电泳图??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｔｈｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｏｒｉｇｉｎａｌ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｂｙ?ＰａｃＩ?ａｎｄ?Ｋｐｎｌ??

经Ｔ４聚合酶末端平齐化处理，Ｔ４连接酶进行质粒自连，转化、挑取阳性菌落、??小提质粒并命名为ｐＧｌｒｋｔ－２，用ＰａｃＩ和Ｋｐｎｌ酶对ｐＧｌｒｋｔ－２进行双酶切验证，电??泳结果显示（图１＿２），与预期结果相符，表明ＧＡＧ启动子己被完全切除且自??连成功。??１?２?３?Ｍ??■....

图１－３?同源臂ＰＣＲ产物电泳图??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｃａｔｔｌｅ?ＮＡＮＯＧ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??

?同源臂ＰＣＲ产物电泳图??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｃａｔｔｌｅ?ＮＡＮＯＧ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ａｒｍｓ??Ｍ为ｌｋｂ?Ｐｈｉｓ?ｍａｒｋｅｒ；左图１－４为３’同源臂ＰＣＲ产物；右图１－４为５’同源臂ＰＣＲ产物??Ｍ：ｌｋｂ?Ｐｌｕｓ?ｍａ....

图１－５酶切鉴定ｐＮｌｒ载体电泳图

?１?｜?ｆ＇、．、．，：，：：?ｊ?…Ｊ丨?＜—９１６ｂｐ??．图１－５酶切鉴定ｐＮｌｒ载体电泳图?图１－６酶切鉴定ｐＮｌｒｋｔ载体电泳图??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?Ｆｉｇｕｒｅ?１－６?Ｔｈｅ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉ....

图１＿７绿色荧光蛋白在在人胚胎干细胞的表达情况??Ｆｉｇｕｒｅ?ｌ－７Ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＥＧＦＰ?ｉｎ?ｈｕｍａｎ?ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ?ｓｔｅｍ?ｃｅｌｌｓ??

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本文编号：4021816