哈氏噬纤维细菌类多糖利用（PUL-like）基因簇中基因chu 1 279在纤维素降解中的作用
发布时间：2025-01-15 19:04
木质纤维素是自然界最丰富的可再生生物质资源,其高效降解转化可以生产生物燃料和其它生物基产品,具有广阔的应用前景。自然界中存在着一些能够高效降解纤维素的微生物,其中,拟杆菌门成员往往通过基因组中的多糖利用座位（Polysaccharide utilization locus,PULs）基因簇编码的淀粉利用系统（Starch Utilization System,Sus）或类淀粉利用系统（Sus-like）实现多糖底物的降解、吸收与利用。拟杆菌门的哈氏噬纤维菌（Cytophaga hutchinsoni）是一种能够高效降解水不溶性结晶纤维素的好氧的革兰氏阴性菌。与已知的其它微生物降解纤维素的策略不同,C.hutchinsoni不分泌胞外游离的纤维素酶也不在细胞表面形成纤维小体结构,其纤维素酶结构中也不含明显的能够与纤维素结合的碳水化合物结合模块（Carbohydrate Binding Modle,CBM）,人们推测,C.hutchinsoni可能利用一种新颖的机制完成对结晶纤维素的高效降解,但是这种机制目前还不是十分清楚。本实验室研究发现,C.hutchiinsoni中可能存在一个与PUL...
【文章页数】：110 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
1.1 纤维素的结构
1.2 纤维素的生物降解
1.2.1 纤维素降解微生物
1.2.2 纤维素的生物降解策略
1.3 多糖利用座位的研究
1.4 碳水化合物结合模块的分类与功能
1.5 哈氏噬纤维菌的研究
1.5.1 哈氏噬纤维素菌中多糖利用座位的研究
1.5.2 哈氏噬纤维菌纤维素吸附的研究
1.6 论文立题依据及研究内容
第二章 chu1279缺失突变株构建及表型分析
2.1 材料与试剂
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 引物
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂
2.1.5 培养基与培养条件
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 常规分子生物学实验方法
2.2.3 C.hutchinsonii基因组提取
2.2.4 C.hutchinsonii电转化
2.2.5 回补载体构建
2.2.6 C.hutchinsonii生长性质测定
2.2.7 C.hutchinsonii纤维素酶酶活测定
2.2.8 菌体的纤维素吸附测定
2.3 结果与分析
2.3.1 chu1279基因序列分析
2.3.2 chu1279缺失突变株的构建
2.3.3 突变株Δ1279在不同碳源培养基中的生长测定
2.3.4 突变株Δ1279纤维素酶活测定
2.3.5 突变株Δ1279对纤维素吸附能力测定
2.4 小结与讨论
第三章 CHU1279重组蛋白的表达纯化与功能探究
3.1 材料与试剂
3.1.1 菌株与质粒
3.1.2 引物
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要试剂
3.1.5 培养基与培养条件
3.2 实验方法
3.2.1 重组表达质粒与重组工程菌株的构建
3.2.2 蛋白诱导表达与纯化
3.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.2.4 蛋白浓度测定
3.2.5 蛋白缓冲液置换方法
3.2.6 蛋白吸附多糖能力的测定
3.2.7 SEM观察CHU1279孵育滤纸表面纤维素形态变化
3.2.8 DSC测定热稳定性变化
3.2.9 蛋白结晶条件筛选与优化
3.2.10 XRD检测CHU1279孵育纤维素结晶度变化
3.3 结果与分析
3.3.1 重组蛋白的异源表达与纯化
3.3.2 蛋白吸附性质测定
3.3.3 差示扫描量热法测定热稳定性变化
3.3.4 SEM观察CHU1279对滤纸表面纤维素结构的破坏作用
3.3.5 CHU1279蛋白结晶条件筛选与优化
3.3.6 CHU1279同源蛋白功能研究
3.4 讨论与小结
第四章 CHU1279参与吸附纤维素的重要氨基酸位点的鉴定
4.1 材料与试剂
4.1.1 菌株与质粒
4.1.2 引物
4.1.3 主要仪器
4.1.4 主要试剂
4.1.5 培养基与培养条件
4.2 实验方法
4.2.1 CHU1279突变体构建方法
4.2.2 突变体蛋白对纤维素吸附定性定量实验
4.2.3 圆二色谱测定蛋白二级结构变化
4.3 实验结果
4.3.1 CHU1279突变体构建及表达
4.3.2 突变体蛋白与纤维素的结合作用分析
4.3.3 圆二色谱测定氨基酸点突变对CHU1279二级结构的影响
4.4 讨论与小结
全文总结
参考文献
致谢
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：4027722
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【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 绪论
1.1 纤维素的结构
1.2 纤维素的生物降解
1.2.1 纤维素降解微生物
1.2.2 纤维素的生物降解策略
1.3 多糖利用座位的研究
1.4 碳水化合物结合模块的分类与功能
1.5 哈氏噬纤维菌的研究
1.5.1 哈氏噬纤维素菌中多糖利用座位的研究
1.5.2 哈氏噬纤维菌纤维素吸附的研究
1.6 论文立题依据及研究内容
第二章 chu1279缺失突变株构建及表型分析
2.1 材料与试剂
2.1.1 菌株与质粒
2.1.2 引物
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要试剂
2.1.5 培养基与培养条件
2.2 实验方法
2.2.1 生物信息学分析
2.2.2 常规分子生物学实验方法
2.2.3 C.hutchinsonii基因组提取
2.2.4 C.hutchinsonii电转化
2.2.5 回补载体构建
2.2.6 C.hutchinsonii生长性质测定
2.2.7 C.hutchinsonii纤维素酶酶活测定
2.2.8 菌体的纤维素吸附测定
2.3 结果与分析
2.3.1 chu1279基因序列分析
2.3.2 chu1279缺失突变株的构建
2.3.3 突变株Δ1279在不同碳源培养基中的生长测定
2.3.4 突变株Δ1279纤维素酶活测定
2.3.5 突变株Δ1279对纤维素吸附能力测定
2.4 小结与讨论
第三章 CHU1279重组蛋白的表达纯化与功能探究
3.1 材料与试剂
3.1.1 菌株与质粒
3.1.2 引物
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要试剂
3.1.5 培养基与培养条件
3.2 实验方法
3.2.1 重组表达质粒与重组工程菌株的构建
3.2.2 蛋白诱导表达与纯化
3.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.2.4 蛋白浓度测定
3.2.5 蛋白缓冲液置换方法
3.2.6 蛋白吸附多糖能力的测定
3.2.7 SEM观察CHU1279孵育滤纸表面纤维素形态变化
3.2.8 DSC测定热稳定性变化
3.2.9 蛋白结晶条件筛选与优化
3.2.10 XRD检测CHU1279孵育纤维素结晶度变化
3.3 结果与分析
3.3.1 重组蛋白的异源表达与纯化
3.3.2 蛋白吸附性质测定
3.3.3 差示扫描量热法测定热稳定性变化
3.3.4 SEM观察CHU1279对滤纸表面纤维素结构的破坏作用
3.3.5 CHU1279蛋白结晶条件筛选与优化
3.3.6 CHU1279同源蛋白功能研究
3.4 讨论与小结
第四章 CHU1279参与吸附纤维素的重要氨基酸位点的鉴定
4.1 材料与试剂
4.1.1 菌株与质粒
4.1.2 引物
4.1.3 主要仪器
4.1.4 主要试剂
4.1.5 培养基与培养条件
4.2 实验方法
4.2.1 CHU1279突变体构建方法
4.2.2 突变体蛋白对纤维素吸附定性定量实验
4.2.3 圆二色谱测定蛋白二级结构变化
4.3 实验结果
4.3.1 CHU1279突变体构建及表达
4.3.2 突变体蛋白与纤维素的结合作用分析
4.3.3 圆二色谱测定氨基酸点突变对CHU1279二级结构的影响
4.4 讨论与小结
全文总结
参考文献
致谢
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：4027722
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