穿膜肽TAT介导的河南华溪蟹金属硫蛋白的融合表达与活性研究

发布时间：2025-02-09 12:29

　　金属硫蛋白(Metallothionein,MTs)是一类含有丰富的半胱氨酸的金属结合蛋白,能减少自由基对机体的损伤,其在抗衰老,抗氧化,抗肿瘤等过程中发挥着重要影响。本实验室前期成功从河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)中克隆出MT cDNA全长并进行了一系列研究。以此为基础,本研究引入人免疫缺陷病毒反式激活因子(Human immunodeficiency virus transactivator,TAT)穿膜肽,旨在制备一种由TAT介导的能够跨膜转导进入生物体细胞的MT,并进一步研究其穿膜活性及对细胞氧化损伤的修复作用。主要研究内容为:首先利用生物信息学软件分析融合蛋白TAT-MT的理化性质及结构的变化;通过PCR技术在目的基因中加入TAT序列,构建pMD19-T-TAT-MT克隆载体和pEXsec1-TAT-MT、pET28a-SUMO-TAT-MT、pET28a-TAT-MT等原核表达载体;表达TAT-MT重组蛋白并用亲和层析方法进行分离纯化;利用免疫荧光技术检测重组融合蛋白TAT-MT的穿膜活性;测定TAT-MT的体外羟自由基清除率及总抗氧化能力;利用MT...

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 综述
    1 金属硫蛋白概述
        1.1 金属硫蛋白的理化特性
        1.2 金属硫蛋白的生理功能
    2 细胞穿膜肽概述
        2.1 HIV-TAT穿膜肽的结构
        2.2 TAT蛋白穿膜的机制
        2.3 TAT蛋白的应用
    3 重组蛋白表达系统的选择
    4 本论文的研究目的及意义
第二章 河南华溪蟹TAT-MT重组融合蛋白的生物信息学分析
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验方法
    2 结果
        2.1 TAT-MT融合蛋白理化性质分析
        2.2 TAT-MT融合蛋白亲水性/疏水性预测与分析
        2.3 TAT-MT融合蛋白跨膜区预测与分析
        2.4 TAT-MT融合蛋白二级结构预测与分析
        2.5 TAT-MT融合蛋白三级结构预测与分析
    3 讨论
第三章 河南华溪蟹TAT-MT融合蛋白表达载体的构建
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 实验方法
    2 结果
        2.1 长引物PCR扩增TAT-MT、MT基因
        2.2 克隆载体的构建
        2.3 原核表达载体pET28a-SUMO-MT、pET28a-SUMO-TAT-MT的构建
        2.4 原核表达载体pEXsec1-TAT-MT、pET28a-TAT-MT的构建
    3 讨论
第四章 河南华溪蟹TAT-MT融合蛋白的优化表达与纯化
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 实验方法
    2 结果
        2.1 重组SUMO-MT、SUMO-TAT-MT、TAT-MT诱导表达条件的优化
        2.2 重组TAT-MT融合蛋白的纯化
    3 讨论
第五章 TAT-MT的细胞膜穿透作用及活性检测
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器
        1.4 实验方法
    2 结果
        2.1 TAT介导的金属硫蛋白的细胞穿膜能力
        2.2 TAT介导的金属硫蛋白对细胞氧化损伤的修复作用
        2.3 TAT介导的金属硫蛋白羟自由基清除率的测定
        2.4 TAT介导的金属硫蛋白总抗氧化能力(T-AOC)的测定
    3 讨论
第六章 总结与展望
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简况及联系方式



本文编号：4032232