CRISPR/Cas9编辑绒山羊FGF5基因细胞株的建立

发布时间：2025-03-19 21:35

　　内蒙古白绒山羊羊绒的品质、产量与次级毛囊的生长周期密切相关,研究证明,FGFs基因家族中成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor,FGF5 具有调控毛囊生长周期的功能。FGF5基因发生突变会使毛囊生长期延长,从而促进毛发生长。本研究通过构建gRNA-CRISPR/Cas9质粒载体,电穿孔法转染绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞后采用单细胞接种法接种单细胞并扩繁,提取基因组DNA,经PCR及测序分析得到了双等位基因编辑的细胞株,可作为供体细胞构建FGF5基因编辑的绒山羊重构胚,为高产绒性状的绒山羊生产奠定研究基础。1.根据绒山羊FGF5基因的第一外显子序列设计2个gRNA靶点识别序列,分别构建pCas9-FGF5-1、pCas9-FGF5-2质粒载体。测序分析证明两个载体构建正确。经T7核酸内切酶Ⅰ检测法及SSA活性检测法鉴定,两个载体均具有活性,pCS7-FGF5-2活性较高,用于后续实验。2.应用NEPA21高效基因转染系统转染内蒙古白绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞,48 h后接种单细胞培养并扩繁,共成功培养135个单细胞株。鉴定分析后得到20个FGF5基因突变细胞株。经...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表
1 引言
    1.1 毛囊的组成及周期
    1.2 FGF5基因的功能及研究
    1.3 基因编辑技术的发展
        1.3.1 锌指酶技术
        1.3.2 TALEN技术
        1.3.3 CRISPR/Cas9技术
    1.4 基因编辑技术的应用
        1.4.1 CRIPSR/cas9基因编辑技术的应用
    1.5 本研究的目的意义及内容
2 CRISPR/Cas9编辑绒山羊FGF5基因真核表达载体的构建及活性检测
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验设备及耗材
        2.1.2 实验试剂及配制
        2.1.3 载体及菌种
    2.2 实验方法
        2.2.1 CRISPR/gRNA载体构建
        2.2.2 SSA活性检测Cas/gRNA质粒活性
        2.2.3 T7核酸内切酶Ⅰ法检测Cas/gRNA质粒活性
    2.3 实验结果
        2.3.1 Cas/gRNA载体构建
        2.3.2 SSA活性检测Cas/gRNA质粒活性
        2.3.3 T7核酸内切酶Ⅰ法检测Cas/gRNA质粒活性
    2.4 讨论
3 CRISPR/Cas9技术编辑绒山羊FGF5基因细胞株的建立
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验设备
        3.1.2 实验试剂及及耗材
        3.1.3 实验主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 质粒准备
        3.2.2 绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞的复苏
        3.2.3 绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞的传代
        3.2.4 绒山羊胎儿皮肤成纤维细胞的冻存
        3.2.5 细胞转染
        3.2.6 单细胞的培养与鉴定
        3.2.7 细胞基因组DNA提取及测序鉴定
    3.3 实验结果
        3.3.1 细胞转染
        3.3.2 单细胞的筛选及扩大培养
        3.3.3 转基因细胞株的鉴定
    3.4 讨论
4 全文结论
致谢
参考文献
附录
作者简介



本文编号：4036893