干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM3的结构和功能的液体核磁共振与电子顺磁共振研究
发布时间：2017-06-01 18:10
本文关键词：干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM3的结构和功能的液体核磁共振与电子顺磁共振研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：在本论文中我们应用液体核磁共振和电子顺磁共振方法研究干扰素诱导的跨膜蛋白3(Interferon-Induced Transmembrane Protein 3,简写为IFITM3)的结构和动力学特性。本论文共分为五个章节。第一章简要介绍了生物膜在生命活动中的重要功能和作用包括细胞膜的结构、主要组成成分以及维系其结构的各种相互作用。同时针对当前研究膜蛋白结构和功能的方法进行了概述,这些方法包括X射线衍射晶体,液体核磁共振,冷冻电镜等。由于能够于较宽的时间尺度内(从皮秒到小时)研究水溶液中蛋白质分子的动力学性质,液体核磁共振相比其它方法具有较强的优势。但是蛋白质的液体核磁共振研究也受到分子量大小,柔性等因素的影响和限制。第二章针对液体核磁共振研究膜蛋白结构和功能的理论和实验方法进行了概述。相关介绍包括核磁共振现象和核磁共振的基本理论(原子核的自旋性质,塞曼裂分,能级间的跃迁,弛豫性质以及化学位移等)和液体核磁共振研究方法(核磁仪器的组成,数据采集,常用的数据处理方法,脉冲技术,去耦和水峰抑制等)。本章还介绍了研究蛋白质结构和功能常用的一维氢谱,同核多维谱,异核多维谱,弛豫实验以及后续的化学位移归属和结构计算等技术。第三章是关于干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM3的背景介绍。本章介绍了病毒的基本情况和其与疾病的关系,通过对前人研究的总结详细说明了IFITM基因在人和小鼠的基因组中的分布情况, IFITM蛋白在生命活动中的作用(主要是在免疫活动中,对多种病毒的抵抗和限制作用)。本章还通过之前的研究概述了目前关于IFITM3蛋白的结构相关研究情况。目前,关于IFITM蛋白的结构研究主要有三种推论,即本章中所述的三种拓扑结构模型。第四章是我们对IFITM3蛋白的液体核磁研究的过程和最终的研究结果。我们首先对IFITM3进行了同源性分析,二级结构预测和跨膜特性预测等准备工作,通过基因合成的方法构建了蛋白表达载体。我们通过实验对IFITM3蛋白质表达,纯化,去垢剂等条件进行了筛选和优化,并确定了最适条件。本章重点介绍了IFITM3蛋白的液体核磁共振的实验过程,包括样品准备,核磁实验条件优化,二维和三维核磁数据采集,数据处理,各个原子化学位移的归属和结构计算等。之后,我们展示了IFITM3蛋白的表达纯化,液体核磁共振实验和数据处理的结果,并对结果进行了分析和讨论。通过液体核磁实验,我们得到了一个低分辨率IFITM3的结构,它由两段螺旋构成,一个位于C端,另一个位于中间位置,而N端是较长的一段无规卷曲。通过相关动力学实验分析,我们确定这两个螺旋和细胞膜都具有相互作用。第五章内容是关于IFITM3蛋白的电子顺磁共振研究实验。本章简要介绍了电子顺磁共振研究的背景知识,位点特异性自旋标记电子顺磁共振研究的实验方法和过程。之后,本章重点介绍了是IFITM3的电子顺磁共振研究过程,包括突变位点的设计与引入,蛋白质的表达和纯化,ERP样品的准备,实验数据的采集和处理等。本章最后对EPR的实验结果进行了详细的讨论分析。实验结果证明了IFITM3的拓扑结构模型：C端螺旋穿过细胞膜,N端螺旋和较长的无规卷曲则位于细胞质中,N端螺旋不穿过细胞膜,停靠在细胞膜内侧。
【关键词】：液体核磁共振 膜蛋白 IFITM3 干扰素 电子顺磁共振 EPR
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51
【目录】：
- 摘要5-7
- Abshact7-12
- 第一章 膜蛋白及其结构研究背景介绍12-20
- 1.1 膜蛋白概述12-13
- 1.2 膜蛋白的结构与功能研究方法13-14
- 1.3 膜蛋白结构研究进展与展望14-16
- 参考文献16-20
- 第二章 膜蛋白研究的液体核磁共振方法20-40
- 2.1 液体核磁共振基本理论20-24
- 2.1.1 核磁共振现象与基本理论概述20-21
- 2.1.2 弛豫21-23
- 2.1.3 化学位移23-24
- 2.2 液体核磁共振研究蛋白质结构的基本实验方法24-37
- 2.2.1 基本实验技术24-28
- 2.2.2 一维氢谱实验28
- 2.2.3 同核多维谱实验28-30
- 2.2.4 异核多维谱实验30-34
- 2.2.5 弛豫实验34-35
- 2.2.6 化学位移归属与结构计算35-37
- 参考文献37-40
- 第三章 干扰素诱导的跨膜蛋白工FITM3背景介绍40-52
- 3.1 引言40-41
- 3.2 IFITM3背景信息41-45
- 3.3 IFITM3的结构相关信息45-49
- 3.3.1 拓扑结构模型一45-46
- 3.3.2 拓扑结构模型二46-47
- 3.3.3 拓扑结构模型三47-49
- 参考文献49-52
- 第四章 IFITM3的液体核磁共振研究52-74
- 4.1 IFITM3同源性分析与结构预测52-56
- 4.1.1 IFITM3同源性分析52-53
- 4.1.2 IFITM3的二级结构预测53-54
- 4.1.3 IFITM3的跨膜特性预测54-56
- 4.2 实验材料和实验方法56-62
- 4.2.1 表达载体的构建56
- 4.2.2 表达条件的优化56-57
- 4.2.3 目的蛋白质的纯化与去垢剂的筛选57-58
- 4.2.4 目的蛋白质的鉴定与稳定性分析58
- 4.2.5 核磁样品准备58
- 4.2.6 核磁实验条件的优化58-59
- 4.2.7 核磁实验与数据处理59
- 4.2.8 化学位移归属与结构计算59-62
- 4.3 实验结果与讨论62-71
- 4.3.1 IFITM3表达条件筛选62-63
- 4.3.2 IFITM3的表达纯化、去垢剂筛选和热稳定性实验63-64
- 4.3.3 IFITM3在不同温度下的液体核磁光谱64-65
- 4.3.4 IFITM3的液体核磁共振实验65-67
- 4.3.5 IFITM3的化学位移归属67-69
- 4.3.6 IFITM3的结构计算69-70
- 4.3.7 IFITM3的主链动力学分析70-71
- 4.4 本章总结71-72
- 参考文献72-74
- 第五章 工FITM3的电子顺磁共振研究74-89
- 5.1 电子顺磁共振研究介绍74-79
- 5.1.1 电子顺磁共振理论简介74-76
- 5.1.2 电子顺磁共振谱仪简介76-77
- 5.1.3 位点特异性自旋标记电子顺磁共振77-79
- 5.2 实验材料与实验方法79-82
- 5.2.1 突变位点设计79
- 5.2.2 分子克隆引入半胱氨酸突变79-81
- 5.2.3 蛋白质表达与纯化81
- 5.2.4 EPR样品制备81
- 5.2.5 实验数据采集81-82
- 5.3 实验结果与讨论82-87
- 5.3.1 IFITM3各突变体表达纯化结果82-83
- 5.3.2 IFITM3的CW-EPR实验83-84
- 5.3.3 IFITM3跨膜区的动力学特征分析84
- 5.3.4 IFITM3跨膜区位点的易趋性分析84-87
- 5.4 本章总结87-88
- 参考文献88-89
- 附录一 常用核磁共振研究的自旋核的物理参数89-90
- 附录二 常用蛋白质表达培养基与纯化缓冲液配方90-91
- 附录三 常用去垢剂参数列表91-92
- 附录四 IFITM3结构计算脚本文件mkpsf.inp92-96
- 附录五 IFITM3结构计算脚本文件anneal.inp96-104
- 附录六 电子顺磁共振研究IFITM3的易趋性数据列表104-106
- 致谢106-107
- 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果107
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