扩展青霉脂肪酶的定向进化及其稳定性的提高

发布时间：2017-07-08 12:16

  本文关键词：扩展青霉脂肪酶的定向进化及其稳定性的提高

  更多相关文章： 扩展青霉脂肪酶 定点突变 热稳定性 有机溶剂耐受性

【摘要】：天然扩展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipase, PEL)的催化特性有其自身的特色,但其在热稳定性、有机溶剂耐受性等方面,还不能很好地满足实际应用的需求。本文利用定点饱和突变技术对PEL的特定位点进行改造,筛选得到PEL突变体,借助毕赤酵母表达系统进行表达,并对其酶学性质进一步分析与鉴定,旨在提高酶的热稳定性和有机溶剂耐受性,为其进一步应用提供更好的酶源。具体研究内容和主要结果如下：1、突变体库建立和高活性突变株筛选设计简并引物,对扩展青霉脂肪酶的92位点进行定点饱和突变,PCR扩增后在原核表达系统中表达,并用三丁酸甘油酯乳化液平板筛选突变株,初步得到1株稳定性高高于野生型脂肪酶的突变株：D92E。同时,根据筛选的结果和半理性设计的方法,设计了三个定点突变实验,得到三个突变株：T66E、N73Q和D151E。2、突变体的表达及其酶学性质分析将筛选得到的脂肪酶突变体连接到表达载体pPIC3.5k上,得到四个重组质粒pPIC3.5k-PEL-D92E、pPIC3.5k-PEL-T66E、pPIC3.5k-PEL-N73Q和pPIC3.5k-PEL-D151E。用Sal线性化这四个重组质粒,并电转至毕赤酵母GS5,甲醇诱导表达。然后对其热稳定性及有机溶剂稳定性进行了分析与鉴定。主要结果如下：(1)与野生型脂肪酶相比,突变体D92E热稳定性得到较明显的提高,在50℃处理10min后,野生型脂肪酶的残余酶活只有31.72%,而突变体D92E脂肪酶的残余酶活为70.28%；突变体D151E比野生型脂肪酶的热稳定性稍有提高,提高不明显；突变体T66E和N73Q比野生型脂肪酶的热稳定性均下降明显。(2)突变体D92E和D151E比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均有所提高,加入乙醇37℃孵育10 min后,突变体D92E脂肪酶的残余酶活为88.32%,突变体D151E脂肪酶的残余酶活为95.47%,野生型脂肪酶的残余酶活为62.06%；突变体T66E和N73Q比野生型脂肪酶的乙醇耐受性均下降明显。
【关键词】：扩展青霉脂肪酶 定点突变 热稳定性 有机溶剂耐受性
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q814
【目录】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-9
• 绪论9-27
• 1.1 脂肪酶的研究进展9-15
• 1.2 脂肪酶的毕赤酵母表达系统研究进展15-16
• 1.3 酶制剂体外定向进化的研究进展16-21
• 1.4 脂肪酶稳定性相关研究进展21-25
• 1.5 本论文的研究思路及意义25-27
• 第一章 扩展青霉脂肪酶D92位点突变体库的构建及筛选27-37
• 1.1 前言27
• 1.2 材料27-29
• 1.3 方法29-32
• 1.4 结果与分析32-34
• 1.5 讨论34-37
• 第二章 突变体T66E、N73Q、D151E的构建及表达37-53
• 2.1 前言37-38
• 2.2 材料38-40
• 2.3 方法40-46
• 2.4 结果46-50
• 2.5 讨论50-53
• 第三章 突变体的酶学性质研究53-67
• 3.1 前言53-54
• 3.2 材料54
• 3.3 方法54-55
• 3.4 结果与分析55-59
• 3.5 讨论59-67
• 第四章 总结与展望67-69
• 4.1 创新点67
• 4.2 总结67-68
• 4.3 展望68-69
• 参考文献69-79
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果79-81
• 致谢81-83
• 个人简历83-87

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本文编号：534522