串联启动子对细菌微氧合成聚羟基丁酸酯的影响

发布时间：2017-07-18 08:05

  本文关键词：串联启动子对细菌微氧合成聚羟基丁酸酯的影响

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【摘要】：聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类由微生物合成的高分子聚酯,具有广阔的应用前景,然而其居高不下的生产成本极大的限制了其工业化生产和应用。在发酵后期由于菌体大量生长使得发酵液中的溶氧迅速降低,从而使菌体不可避免的处于微氧发酵的状态。因此可以采用两步发酵法来生产PHA:有氧条件下菌体快速生长,而在微氧条件下菌体大量积累PHA。本文以重组大肠杆菌和盐单胞菌为研究对象,尝试提高菌株微氧合成PHB的能力,从而降低PHA的生产成本。为了提高菌株在微氧条件下PHB合成相关基因的转录水平,微氧启动子被应用到PHB的生产中。确定了11个潜在的大肠杆菌微氧启动子,通过两轮筛选得到了在微氧条件下具有较高活性的透明颤菌血红蛋白启动子(Pvgb)。将Pvgb应用于大肠杆菌的微氧生产中,使重组菌株中PHB的含量达到了68.48%,比对照菌株提高了13%。其次,通过串联vgb启动子(Pnvgb)得到了一个微氧转录活性显著提高的启动子:P8vgb。在微氧条件下,重组菌株E.coliS17-1(pBHR-P8vgb)积累了5.4g/L的细胞干重和90%的PHB。qPCR分析重组菌株phaC的转录水平表明:phaC基因的转录水平与PHB合成量呈正相关,P8vgb具有最强的微氧转录活性。接下来,对6株常用大肠杆菌的PHB微氧合成能力进行了比较,E.coliS17-1为最适菌株。通过敲除arcA基因进一步提高了其微氧适应性,重组菌株E.coliS17-1△arcA(pBHR-P8vgb)的PHB积累量为91%,细胞干重达6.3g/L。最后,在嗜盐菌Halomonas sp.LS21中构建P8vgb调控下的VHb和phaCABLS21共表达质粒能显著提高重组菌株的PHB微氧合成量和细胞干重。重组菌株Halomonas sp.LS21(pSEVA341-P8vgb-vgb-P8vgb-phaCABLS21)的PHB积累量为75%,比对照菌株提高了35%,细胞干重达4.5g/L,是对照组的两倍。发酵实验表明:重组菌株PHB的积累量为75.32%,比对照菌株提高了25%;细胞干重达30.21g/L,比对照组提高了10g/L。P8vgb是一个高效的微氧启动子,共表达VHb蛋白和phaCABLS21能显著提高菌株Halomonas sp.LS21的PHB含量和细胞干重。
【关键词】：聚羟基丁酸酯 微氧启动子 串联vgb启动子 盐单胞菌
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;Q936
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要符号对照表9-10
• 第1章 引言10-26
• 1.1 聚羟基脂肪酸酯概述10-15
• 1.1.1 PHA简介10
• 1.1.2 PHA结构及分类10-12
• 1.1.3 PHA的材料学性能12-14
• 1.1.4 PHA的应用14-15
• 1.2 聚羟基脂肪酸酯的生物合成途径及主要酶15-19
• 1.2.1 PHA主要生物合成途径15-16
• 1.2.2 PHA聚合酶（PhaC）16-17
• 1.2.3 PHA代谢相关基因17-19
• 1.3 PHB的发酵生产19-21
• 1.3.1 利用野生型菌株生产PHB19-21
• 1.3.2 利用重组E.coli生产PHB21
• 1.4 PHA的低成本生产策略21-22
• 1.5 PHB的微氧合成22-24
• 1.5.1 氧气对PHB合成的影响22-23
• 1.5.2 E. coli微氧代谢及调控系统23-24
• 1.5.3 E. coliPHB的微氧合成24
• 1.6 本论文的主要工作及意义24-26
• 第2章 实验材料与方法26-39
• 2.1 实验材料26-30
• 2.1.1 菌种26-27
• 2.1.2 质粒27-28
• 2.1.3 常用分子生物学试剂28-29
• 2.1.4 常用生物化学试剂29
• 2.1.5 DNA分子量标准29-30
• 2.2 实验常用仪器及设备30-31
• 2.3 实验方法31-39
• 2.3.1 常用培养基及抗生素的配制31
• 2.3.2 分子生物学实验方法31-36
• 2.3.3 菌种的保存36
• 2.3.4 摇瓶和发酵罐培养36-37
• 2.3.5 理化分析方法37-39
• 第3章 利用微氧启动子提高菌株PHB微氧合成量39-47
• 3.1 本章导读39-40
• 3.2 微氧启动子的分析与确定40
• 3.2.1 大肠杆菌转录组分析40
• 3.2.2 确定11个微氧启动子序列40
• 3.3 质粒与重组菌的构建40-45
• 3.3.1 扩增11个大肠杆菌微氧启动子40-42
• 3.3.2 构建微氧启动子调控rfp基因表达的质粒42
• 3.3.3 微氧启动子对RFP荧光强度的影响42-43
• 3.3.4 构建微氧启动子调控phaCAB表达的质粒43-44
• 3.3.5 微氧启动子对PHB合成的影响44-45
• 3.4 本章小结45-47
• 第4章 利用串联vgb启动子（P_(nvgb)）提高PHB微氧合成量47-54
• 4.1 本章导读47
• 4.2 串联vgb启动子（P_(nvgb)）的构建47-49
• 4.3 利用串联vgb启动子（P_(nvgb)）提高PHB微氧合成量49-50
• 4.3.1 构建串联vgb启动子（P_(nvgb)）调控下的phaCAB表达质粒49
• 4.3.2 串联vgb启动子（P_(nvgb)）对PHB微氧合成量的影响49-50
• 4.4 串联vgb启动子（P_(nvgb)）调控下phaC的转录水平50-52
• 4.5 本章小结52-54
• 第5章 E.coli菌株对PHB微氧合成量的影响54-58
• 5.1 本章导读54
• 5.2 E.coli菌株的选择54-55
• 5.2.1 确定6种待筛选E. coli菌株54-55
• 5.2.2 不同菌株对PHB含量的影响55
• 5.3 敲除arcA基因对细胞干重和PHB含量的影响55-57
• 5.4 本章小结57-58
• 第6章 利用P_(8vgb)提高Halomonas sp.LS21菌株PHB微氧合成量58-68
• 6.1 本章导读58-59
• 6.2 异源表达VHb蛋白对菌株PHB微氧合成量的影响59-61
• 6.2.1 构建P_(vgb)、P_(8vgb)调控下的VHb蛋白表达质粒59-60
• 6.2.2 异源表达VHb蛋白对PHB合成量的影响60-61
• 6.3 过表达phaCAB_(LS21)基因簇对菌株PHB合成量的影响61-63
• 6.3.1 构建P_(8vgb)调控下的phaCAB_(LS21)基因簇过表达质粒61-62
• 6.3.2 过表达phaCAB_(LS21)对菌株PHB合成量的影响62-63
• 6.4 共表达VHb蛋白和phaCAB_(LS21)对菌株PHB微氧合成量的影响63-65
• 6.4.1 构建P_(8vgb)调控下的VHb蛋白和phaCAB_(LS21)基因簇共表达质粒63-64
• 6.4.2 共表达VHb蛋白和phaCAB_(LS21)对菌株PHB积累量的影响64-65
• 6.5 共表达VHb蛋白和phaCAB_(LS21)菌株的发酵罐实验65-66
• 6.6 本章小结66-68
• 第7章讨论与展望68-73
• 7.1 论文工作总结与讨论68-69
• 7.2 工作展望69-73
• 7.2.1 利用合成生物学方法构建功能模块69-70
• 7.2.2 不依赖抗生素的表达系统70-71
• 7.2.3 开发生产PHA的平台菌株71
• 7.2.4 开发PHA的高附加值应用71-73
• 参考文献73-81
• 致谢81-83
• 附录A 11个微氧启动子序列83-85
• 附录B 串联vgb启动子（P_(nvgb)）序列85-88
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 SHEN Rui;CAI LongWei;MENG DeChuan;WU LinPing;GUO Kai;DONG GuoXing;LIU Lei;CHEN JinChun;WU Qiong;CHEN GuoQiang;;Benzene containing polyhydroxyalkanoates homo-and copolymers synthesized by genome edited Pseudomonas entomophila[J];Science China(Life Sciences);2014年01期

2 欧阳文竹;黄勇;罗红军;王东山;;聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)/酶解木质素共混材料的制备及性能[J];高分子材料科学与工程;2012年08期

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1 高雪;大肠杆菌中聚羟基脂肪酸酯合成基因的优化和染色体表达[D];清华大学;2013年

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本文编号：556717