氮素对印楝组织细胞基因表达的影响

发布时间：2017-07-18 15:19

  本文关键词：氮素对印楝组织细胞基因表达的影响

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【摘要】：印楝(Azadirachta indica A.Juss)是一种热带植物,含有多种生物活性物质,其中印楝素的生物活性最强。由于印楝分布区域狭窄、生长周期长、繁殖率低等因素,以致从种子中提取其天然代谢物的产量低,限制了它的广泛应用。采用生物技术手段进行工业化生产印楝次生代谢物可较好地改善这一问题。MS培养基,在常用培养基中最有利于印楝的组织培养,其中的氮素由硝态氮与铵态氮组成,二者摩尔比为2：1。当硝态氮与铵态氮摩尔比为3：1时,印楝素全部积累在胞内；当硝态氮与铵态氮摩尔比为4：1时,印楝素全部分泌到胞外。本论文采用了硝态氮与铵态氮摩尔比为2：1、3：1与4：1的3种MS改良培养基,分别培养印楝叶诱导的愈伤组织及其形成的悬浮细胞。继代培养25天左右,测定其生物量、可溶性蛋白、印楝素、柠檬苦素类物质和叶绿素含量；并运用高通量法对其细胞转录组的核苷酸序列进行测序,进一步比较它们的基因表达差异性。结果表明,在N03":NH4+=4:1时,愈伤组织和悬浮细胞中的生物量均达到最大值,分别为25.85 g/L和92.13g/L；愈伤组织中的可溶性蛋白、印楝素、柠檬苦素类物质和叶绿素也达到最高含量,分别为12.67 mg/g、37.55μg/g、116.10 μg/g和30.24mg/kg;而在NO3-:NH4+=3:1时,悬浮细胞中的可溶性蛋白、印楝素、柠檬苦素类物质和叶绿素的含量均达到最大值,分别为10.18 mg/g、35.61μg/g、123.20 μg/g和36.78 mg/kg。不同印楝愈伤组织及细胞经转录组测序和基因表达差异性分析后发现,氮源的含量和形态的变化对萜类前体物质的生物合成影响较小,仅表现在HMGR还原酶和PPI异构酶两种关键性酶活性的上调或下调；对类黄酮物质的生物合成影响较大,表现在多种氧化还原酶、转移酶和异构酶的活性调节中;同时也影响着甾醇、细胞色素P450、核糖体亚基等物质的生物合成代谢过程。因此,培养体系中氮素的变化对印楝印楝素的生物合成代谢有着重要的影响。
【关键词】：印楝 叶绿素 可溶性蛋白 高通量测序 转录组
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-16
• 1.1 印楝素的来源、应用及作用机理8-9
• 1.2 印楝愈伤组织、悬浮细胞的培养9-10
• 1.3 栽培条件对印楝器官中印楝素含量的影响10-11
• 1.4 组织细胞培养中印楝素含量的变化11-12
• 1.5 培养基中氮素对细胞内外印楝素含量的影响12
• 1.6 培养细胞次生代谢物合成与分泌的基因表达特点12-14
• 1.7 转录组测序在印楝中的应用14-15
• 1.8 研究内容及意义15-16
• 1.8.1 立体依据及研究意义15
• 1.8.2 研究内容15-16
• 2 材料与方法16-29
• 2.1 材料16
• 2.2 主要试剂16-18
• 2.3 主要试验仪器18-19
• 2.4 试验方法19-20
• 2.4.1 印楝愈伤组织的诱导19
• 2.4.2 印楝悬浮细胞培养体系的建立19-20
• 2.4.3 铵态氮与硝态氮对愈伤组织继代培养的影响20
• 2.4.4 铵态氮与硝态氮对细胞悬浮培养的影响20
• 2.5 分析方法20-29
• 2.5.1 愈伤组织诱导率的测定20
• 2.5.2 印楝细胞生物量的测定20-21
• 2.5.3 柠檬苦素含量的测定21-22
• 2.5.4 印楝素的含量测定22-23
• 2.5.5 印楝细胞中叶绿素含量的测定23
• 2.5.6 印楝细胞中可溶性蛋白的测定(考马斯亮蓝法)23-25
• 2.5.7 基因表达差异性分析25-27
• 2.5.8 实时荧光定量PCR27-29
• 3 结果与讨论29-59
• 3.1 氮素对印楝组织细胞生长的影响29
• 3.2 氮素对生物量的影响29-30
• 3.3 氮素对可溶性蛋白含量的影响30-31
• 3.4 氮素对印楝素含量的影响31-32
• 3.5 氮素对柠檬苦素含量的影响32
• 3.6 氮素对叶绿素含量的影响32-33
• 3.7 RNA提取与文库构建33-35
• 3.8 高通量测序和Reads的拼接35-37
• 3.9 印楝叶、愈伤组织和悬浮细胞的转录组功能注释及其基因表达差异分析37-39
• 3.10 印楝叶、愈伤组织和悬浮细胞转录组代谢途径的分析39-59
• 3.10.1 差异表达基因的基因本体学(GO)分类39-45
• 3.10.2 差异表达基因的KEGG分析45-59
• 4 结论59-60
• 5 展望60-61
• 6 参考文献61-67
• 7 攻读工学学位期间发表论文情况67-68
• 8 致谢68

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1 林杏芳;印楝研究的进展[J];世界热带农业信息;2000年05期

2 樊荣;;印楝在攀枝花的繁植及推广技术[J];攀枝花科技与信息;2002年04期

3 ;印楝全身都是宝[J];中国科技信息;2003年Z1期

4 郑益兴;吴疆，

本文编号：558355