斑马鱼Ly2基因簇的鉴定、表达与功能研究

发布时间：2017-08-08 06:09

  本文关键词：斑马鱼Ly2基因簇的鉴定、表达与功能研究

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【摘要】：淋巴抗原6 (lymphocyte antigen 6, Ly-6)首次在小鼠淋巴细胞中鉴别出。该家族氨基酸序列具有一个或多个保守的LU结构域,该结构域一般由70到100个氨基酸残基组成,包含8到10个可形成特定二硫键的半胱氨酸,其三级结构为三指蛋白,也称为三指蛋白。该家族分为两个亚家族：一个是分泌性蛋白,如SLURP 1, SLURP2, SP10, PATE家族和一些蛇毒素：另一类是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白,如CD59, PSCA (prostate stem cell antigen), LYNXl (Ly-6/neurotoxin 1)。从低等的无脊椎动物如果蝇,到脊椎动物哺乳类都鉴定出Ly-6家族成员。它们的表达模式和功能具有多样性,在细胞活性、迁移、黏附,神经兴奋性调节和免疫调节过程中起重要的作用。近年来,报道中所鉴定出的Ly-6家族成员大部分为GPI锚定型蛋白,而对分泌性蛋白的发现与鉴定相对较少。更令人遗憾的是,虽然斑马鱼已经成为一个具有多种优势的重要模式动物,但在斑马鱼发育过程中,除了一些笼统的生物学信息学,Ly.6家族成员的鉴定和研究非常匮乏。在本论文中我们在斑马鱼鉴定了三个特异表达于消化系统的新的分泌性Ly-6基因。它们位于2号染色体三个相邻的位置,根据其在染色体上的相对位置,我们将其命名为Ly2.1, Ly2.2, Ly2.3。它们编码的蛋白均具有一个由10个保守的半胱氨酸组成的LU结构域,并且这三个基因的氨基酸序列具有很高的相似性,推测是染色体内基因复制而来。通过三维同源建模分析,发现它们与CD59和SLURP1具有相似的类似三指的三级结构。此后我们通过胚胎的整体原位杂交和胚胎各个时期的实时定量PCR分析了Ly2.1, Ly2.2, Ly2.3的时空表达模式。在斑马鱼胚胎发育的早期,它们均有不同程度的母源性表达,随着胚胎不断发育,三个基因呈现特异的时空表达模式,均在内胚层特异表达,但三个基因的具体表达位置不同。Ly2.1在鱼鳔和鳔管中表达,Ly2.2在72hpf的胰腺中特异表达。Ly2.3在整个消化道以及肝中表达。它们表达于斑马鱼的整个消化道,鱼鳔,肝和胰腺,消化道及相关器官在先天性免疫和适应性免疫应答中具有重要作用,此外,通过抗菌肽预测发现Ly2.1, Ly2.2, Ly2.3均具有潜在的抗菌肽活性：富含10个半胱氨酸,等电点分别为8.5,8.2,8.2,疏水比分别为46%,48%,47%。基于此,我们选取斑马鱼发育的重要时期进行了LPS脂多糖显微注射来模拟感染和细菌入侵。通过实时定量PCR结果显示,在不同发育时期的斑马鱼胚胎注射LPS之后,发现三个基因mRNA水平的表达量都有了不同程度的升高。基于此,我们初步认为在斑马鱼早期胚胎发育过程中,Ly2.1-3在消化道初先天性疫应答中起到重要的作用。总而言之,本文鉴定了斑马鱼2号染色体上三个Ly-6超家族成员,Ly2.1,Ly2.2,Ly2.3,它们的表达部位均在内胚层上,但三者的具体表达并不相同,提示染色体内基因复制后三者可能执行不同的功能,而LPS处理后三者的表达升高提示它们均在免疫调节中起作用,具体的抗菌功能研究仍有待深入。
【关键词】：Ly-6超家族 斑马鱼 基因复制 内胚层 免疫
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略语9-12
• 第一章 文献综述12-32
• 1 Ly-6超家族12-15
• 1.1 Ly-6超家族的特征与分类12
• 1.2 Ly-6组织表达和功能多样性12-14
• 1.2.1 Ly-6在无脊椎动物中的表达和功能12-13
• 1.2.2 Ly-6在脊椎动物中的表达和功能13-14
• 1.3 Ly-6超家族免疫相关性14-15
• 1.4 斑马鱼Ly-6超家族的研究现状15
• 2 斑马鱼消化系统15-23
• 2.1 免疫学研究的新模式生物-斑马鱼15-16
• 2.2 斑马鱼消化系统的发育与功能16-21
• 2.2.1 斑马鱼消化道的起源与形成16-18
• 2.2.2 斑马鱼消化道附属器官的起源与形成18-21
• 2.3 斑马鱼消化系统行使重要功能21-22
• 2.4 消化系统是机体重要的免疫系统之一22-23
• 3 鱼类的先天性免疫系统及应答23-30
• 3.1 Toll样受体23-24
• 3.2 脂多糖24-26
• 3.3 抗菌肽26-30
• 3.3.1 抗菌肽的特征与分类26-27
• 3.3.2 抗菌肽的作用模式27-29
• 3.3.3 抗菌肽为免疫应答的重要部分29-30
• 4 本文研究的目的与意义30-31
• 5 研究的技术路线31-32
• 第二章 斑马鱼Ly2基因簇的鉴定、表达功能研究32-67
• 1 前言32-33
• 2 材料与方法33-47
• 2.1 实验材料与仪器33-36
• 2.1.1 斑马鱼33
• 2.1.2 分子生物实验试剂33
• 2.1.3 主要实验仪器33-34
• 2.1.4 实验常用基础溶液配制34-36
• 2.2 实验方法36-47
• 2.2.1 斑马鱼养殖与胚胎收集36
• 2.2.2 Ly2.1.3生物信息学分析与鉴定36-37
• 2.2.3 斑马鱼Ly2.1-3整体原位杂交37-45
• 2.2.4 冰冻切片45-46
• 2.2.5 斑马鱼kt胎重要发育时期的qReal Time-PCR46-47
• 2.2.6 斑马鱼胚胎显微注射47
• 3 实验结果47-65
• 3.1 斑马鱼Ly2.1-3生物信息学分析与鉴定47-55
• 3.1.1 斑马鱼Ly2.1-3基因组定位和基因结构分析47-49
• 3.1.2 斑马鱼Ly2.1-3与其他物种间Ly-6超家族成员的氨基酸序列分析49-51
• 3.1.3 斑马鱼Ly2.1-3与Ly-6家族进化关系以及三维结构分析51-54
• 3.1.4 斑马鱼Ly2.1-3抗菌肽预测结果分析54-55
• 3.2 斑马鱼Ly2.1.3表达模式的确立55-62
• 3.2.1 斑马鱼早期胚胎原位杂交55-61
• 3.2.2 qRT-PCR检测Ly2.1-3早期胚胎发育过程中的表达61
• 3.2.3 qRT-PCR检测Ly2.1-3在斑马鱼成鱼不同组织的分布与表达61-62
• 3.3 LPS对斑马鱼Ly2.1-3的表达的影响62-65
• 4 讨论65-67
• 结论67-68
• 参考文献68-78
• 致谢78-79
• 作者简介79-80
• 发表的学术论文80

【参考文献】

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1 ;Liver development in zebrafish (Danio rerio)[J];遗传学报;2009年06期

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本文编号：638506