日本七鳃鳗Tec的基因编码区克

发布时间：2017-08-08 08:38

  本文关键词：日本七鳃鳗Tec的基因编码区克隆、重组表达及相关免疫学研究

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【摘要】：Tec酪氨酸蛋白激酶是一种非受体酪氨酸蛋白激酶,它是一种细胞质蛋白,主要表达在免疫相关组织和肝细胞中,Tec参与G蛋白偶联受体和白介素介导的信号通路,调节诸多生物进程,而且还是T细胞受体信号重要的调节分子。本文实验中,在七鳃鳗血液cDNA库中成功克隆Tec ORF区序列。七鳃鳗Tec(Lja-Tec)序列包含1923bpORF区,69bp 5’UTR区以及1037bp 3’UTR区。对其序列进行功能结构域预测,Tec氨基酸序列包含了PH结构域、Btk结构域、SH3结构域、SH2结构域和TKD激酶结构域。而且,对Tec序列进行生物信息学分析,并选取24个物种从哺乳动物到无颌类动物建进化树,以及MEME软件分析其进化历程。发现七鳃鳗Tec位于脊椎动物进化的最低处,符合进化规律。利用RT-PCR法检测Tec基因水平上在七鳃鳗髓样小体、鳃、白细胞、肾和心免疫相关组织中的分布情况,发现刺激后鳃和白细胞中Tec的转录情况明显上调。同时,用western blot分析了Tec转录水平上七鳃鳗刺激前后在以上组织中的表达情况,发现刺激后白细胞的表达明显上调。表明了Tec可能参与免疫应答,在七鳃鳗适应性免疫中起到重要作用。构建了Pet32a(+)-Tec表达载体,转入表达感受态E.coli BL21中进行表达,然后用0.1mmol/LIPTG、30?C诱导蛋白表达,得到了重组蛋白Tec,超声破碎后,Tec蛋白主要在沉淀中表达,为不可溶蛋白。用包涵体纯化方法,经组氨酸亲和层析纯化后,得到纯化的重组蛋白Tec。利用Tec抗体经western blot鉴定Tec重组蛋白和天然蛋白,结果发现Tec蛋白在七鳃鳗白细胞中混合菌刺激前后变化比较明显。接着研究了免疫沉淀,检测与Tec相互作用蛋白,结果还需进一步验证。免疫荧光检测了Tec在白细胞中的定位,结果显示Tec为胞质蛋白。综上所述,以上的研究在七鳃鳗Tec功能或免疫机制研究中提供了重要线索。
【关键词】：日本七鳃鳗 酪氨酸蛋白激酶Tec 分子进化 免疫印迹
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 文章综述10-18
• 1.1 Tec的结构10-11
• 1.2 Tec上游作用分子11-14
• 1.2.1 淋巴细胞表面抗原与Tec作用11-12
• 1.2.2 细胞因子受体与Tec作用12-13
• 1.2.3 异三聚体G蛋白偶联受体（GPCR）与Tec作用13
• 1.2.4 整合素与Tec作用13
• 1.2.5 Tec激酶的负调控13-14
• 1.3 Tec下游作用分子14-15
• 1.3.1 Tec与PLC-γ2 作用15
• 1.3.2 Tec与支架蛋白BRDG1作用15
• 1.3.3 Tec与PI3-K的影响15
• 1.4 Tec在体内的功能15-17
• 1.4.1 诱导Bcl-xl16
• 1.4.2 调节Rho16
• 1.4.3 调控c-fos转录16
• 1.4.4 与T细胞作用16-17
• 1.5 小结17-18
• 第2章 七鳃鳗Tec基因的分子克隆以及生物信息学分析18-40
• 2.1 七鳃鳗Tec基因的分子克隆18-28
• 2.1.1 材料18-19
• 2.1.2 方法19-25
• 2.1.2.1 七鳃鳗白细胞分离19
• 2.1.2.2 总RNA提取--Trizol法19
• 2.1.2.3 引物设计19-20
• 2.1.2.4 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增20-22
• 2.1.2.5 3′RACE扩增反应22-24
• 2.1.2.6 目的片段连接至载体并提质粒测序24-25
• 2.1.3 结果25-28
• 2.1.3.1 总RNA提取--Trizol法25
• 2.1.3.2 检测cDNA模板25-26
• 2.1.3.3 Tec基因编码区扩增26-28
• 2.2 七鳃鳗Tec基因氨基酸序列生物信息学分析28-39
• 2.2.1 软件、在线网站和数据库28-29
• 2.2.2 结果29-39
• 2.2.2.1 理化性质分析29-30
• 2.2.2.2 同原序列比对30-32
• 2.2.2.3 信号肽预测32
• 2.2.2.4 跨膜结构域预测32-33
• 2.2.2.5 功能结构预测33-34
• 2.2.2.6 二级结构域预测34-35
• 2.2.2.7 三级结构预测35
• 2.2.2.8 系统发育分析35-36
• 2.2.2.9 保守基序分析36-39
• 2.3 讨论39
• 2.4 小结39-40
• 第3章 七鳃鳗Tec基因原核表达及蛋白纯化40-52
• 3.1 材料40
• 3.2 方法40-46
• 3.2.1 引物设计40-41
• 3.2.2 PCR扩增41-42
• 3.2.3 切胶回收42
• 3.2.4 目的片段与表达载体相连42
• 3.2.5 转化42
• 3.2.6 阳性菌的鉴定42-43
• 3.2.7 Tec蛋白的诱导表达43
• 3.2.8 SDS-PAGE鉴定43-44
• 3.2.9 重组蛋白的纯化44-46
• 3.2.10 检测重组蛋白浓度46
• 3.3 结果46-51
• 3.4 讨论51
• 3.5 小结51-52
• 第4章 七鳃鳗Tec蛋白相关免疫学研究52-62
• 4.1 实时荧光定量PCR法检测Tec的表达52-55
• 4.1.1 材料52-53
• 4.1.2 方法53-54
• 4.1.2.1 混合菌刺激53
• 4.1.2.2 分离七鳃鳗白细胞53
• 4.1.2.3 Total RNA提取53
• 4.1.2.4 RNA质量检测53
• 4.1.2.5 Real time PCR法检测Tec在各组织的相对表达量53-54
• 4.1.3 结果54-55
• 4.2 免疫学鉴定55-60
• 4.2.1 材料55-56
• 4.2.2 方法56-57
• 4.2.2.1 western blot56
• 4.2.2.2 免疫沉淀56-57
• 4.2.2.3 免疫荧光57
• 4.2.3 结果57-60
• 4.3 讨论60-61
• 4.4 小结61-62
• 结论62-63
• 本文创新点63-64
• 参考文献64-67
• 附录A 不同物种Tec基因的FASTA格式氨基酸序列67-76
• 附录B Pet32a(+)质粒图谱76-77
• 附录C 蛋白浓度测定标准曲线77-78
• 附录D 重组蛋白Tec质谱检测结果78-79
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况79-80
• 致谢80

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