产多酚氧化酶茶叶内生真菌的筛选及酶的分离纯化

发布时间：2017-08-19 01:18

  本文关键词：产多酚氧化酶茶叶内生真菌的筛选及酶的分离纯化

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【摘要】：多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase, PPO)是一类铜蛋白,能有效地催化多酚类化合物氧化形成相应的醌类物质,在含酚废水处理、木质素降解以及染料脱色等领域得到较好的研究和应用,具有广泛的应用前景。茶叶细胞中富含多酚化合物和多酚氧化酶,在茶叶体内生物合成和制茶过程中的物质转化中起重要作用,是红茶和黑茶风味和特质形成的物质基础。本论文以分离自健康茶叶组织的内生真菌为材料,筛选产多酚氧化酶的菌株,研究菌株的培养条件,分离纯化多酚氧化酶,并应用于茶多酚的生物转化,为茶树内生真菌及其多酚氧化酶的利用打下基础。利用平板显色初筛和摇瓶复筛,从14株内生真菌菌株筛选出相对高产多酚氧化酶的菌株CSN-13,通过HPLC检测茶多酚溶液的变化,进一步确定菌株CSN-13产多酚氧化酶的能力。通过形态学鉴定和真菌ITS序列分析,初步鉴定菌株CSN-13为茴麻链格孢(Alternaria abutilonis)。将菌株CSN-13作为出发菌株,利用单因素和响应面法分别对液体发酵培养基和发酵条件进行优化,优化后的酶活比优化前分别提高了8.5倍和10倍。然后利用优化后条件对菌株CSN-13进行液体发酵,通过硫酸铵盐析沉淀、DEAE-阴离子交换层析、葡聚糖G-150凝胶层析等方法进行分离纯化多酚氧化酶,将获得的样品通过SDS-PAGE凝胶电泳后,通过考马斯亮蓝R-250染色,显示两条清晰的蛋白条带,相对分子量分别约为50 kDa和70 kDa。纯化倍数为3.50倍,回收率为3.15%。对纯化后的多酚氧化酶酶学性质进行研究,最适温度为30℃,最适pH为5.5。通过优化后确定产茶树多酚氧化酶的固体发酵培养基,然后将固体发酵后产物和纯化后的多酚氧化酶加入到一定浓度的茶多酚溶液中进行反应,通过HPLC检测,发现多酚物质含量变化大且出现多个未知峰,表明固体发酵和液体发酵产酶均有生物转化作用。
【关键词】：内生真菌 多酚氧化酶 菌株筛选 发酵优化 分离纯化 HPLC
【学位授予单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 中文摘要2-3
• Abstract3-5
• 中文文摘5-12
• 第一章 绪论12-26
• 1 多酚氧化酶概述12-16
• 1.1 多酚氧化酶的结构特点12
• 1.2 多酚氧化酶的分布和分类12-13
• 1.3 多酚氧化酶的催化机理13-14
• 1.4 多酚氧化酶的提取技术14-15
• 1.5 多酚氧化酶活力的测定15-16
• 2 多酚氧化酶分离和酶学性质16-19
• 2.1 多酚氧化酶分离纯化的方法16-17
• 2.2 多酚氧化酶的酶学性质17-18
• 2.3 多酚氧化酶的同工酶18-19
• 3 多酚氧化酶的生理功能19-20
• 3.1 使高等植物组织发生褐变19
• 3.2 与植物抗病作用有关19
• 3.3 参与β-花青素的生物合成19
• 3.4 与绿色植物光合作用有关19
• 3.5 其他生理功能19-20
• 4 多酚氧化酶的应用20-21
• 4.1 多酚氧化酶在食品领域的应用20
• 4.2 多酚氧化酶在医药领域的应用20-21
• 4.3 多酚氧化酶在的其他方面的应用21
• 5 微生物多酚氧化酶应用21
• 6 多酚氧化酶与茶多酚21-22
• 7 研究的主要内容和意义22-26
• 7.1 本研究的主要内容22-23
• 7.2 技术路线23-26
• 第二章 茶叶中产多酚氧化酶真菌的筛选和鉴定26-38
• 2.1 前言26
• 2.2 材料26-28
• 2.2.1 菌种26
• 2.2.2 主要药品及设备26-27
• 2.2.3 培养基及试剂的配制27-28
• 2.3 方法28-30
• 2.3.1 茶叶内生真菌菌的活化28
• 2.3.2 产多酚氧化酶内生真菌菌株初筛28
• 2.3.3 液体发酵复筛28-29
• 2.3.4 菌株形态观察29
• 2.3.5 基因组DNA的提取29
• 2.3.6 PCR反应体系和扩增条件29-30
• 2.3.7 系统发育树的构建30
• 2.4 结果与分析30-35
• 2.4.1 菌株的初筛30-31
• 2.4.2 液体发酵复筛31-33
• 2.4.3 CSN-13形态观察33
• 2.4.4 菌株的ITS测序及系统发育树构建33-35
• 2.5 小结与讨论35-38
• 第三章 菌株CSN-13产多酚氧化酶培养条件优化38-56
• 3.1 前言38
• 3.2 材料38-39
• 3.2.1 菌种38
• 3.2.2 主要试剂38
• 3.2.3 主要仪器设备38
• 3.2.4 培养基及试剂的配制38-39
• 3.3 方法39-40
• 3.3.1 菌种活化39
• 3.3.2 发酵培养基优化39
• 3.3.3 发酵条件优化39-40
• 3.3.4 Plackett-Burman设计和响应面设计优化40
• 3.4 结果与分析40-53
• 3.4.1 发酵培养基优化40-43
• 3.4.1.1 碳源对产酶的影响40
• 3.4.1.2 麸皮浓度对产酶的影响40-41
• 3.4.1.4 氮源对产酶的影响41
• 3.4.1.5 硝酸铵浓度对产酶的影响41-42
• 3.4.1.6 茶水对产酶的影响42
• 3.4.1.7 茶水浓度对产酶的影响42-43
• 3.4.2 发酵条件优化43-45
• 3.4.2.1 培养时间对菌株CSN-13产多酚氧化酶的影响43
• 3.4.2.2 发酵温度对产酶的影响43-44
• 3.4.2.3 初始pH对产酶的影响44
• 3.4.2.4 转速对产酶的影响44-45
• 3.4.2.5 培养基和发酵条件优化后菌株CSN-13产多酚氧化酶的动态变化45
• 3.4.3 Plackett-Burman设计和响应面设计优化45-53
• 3.4.3.1 Plackett-Burman设计法筛选影响液体发酵产多酚氧化酶的显著因子45-47
• 3.4.3.2 最陡爬坡实验47-48
• 3.4.3.3 Box-Behnken响应面实验设计与结果48-53
• 3.4.4 响应面优化法最优配方的验证53
• 3.5 小结与讨论53-56
• 第四章 多酚氧化酶的分离、纯化和酶学性质研究56-70
• 4.1 前言56
• 4.2 材料56-58
• 4.2.1 菌种56
• 4.2.2 主要药品及设备56-57
• 4.2.3 主要试剂的配制57-58
• 4.3 方法58-61
• 4.3.1 蛋白质含量测定58-59
• 4.3.2 多酚氧化酶酶活测定59
• 4.3.3 多酚氧化酶的分离纯化59-60
• 4.3.3.1 粗酶液的提取59
• 4.3.3.2 硫酸铵分级沉淀59-60
• 4.3.3.3 DEAE-纤维素阴离子交换柱层析60
• 4.3.3.4 葡聚糖G-150凝胶柱层析60
• 4.3.3.5 SDS-PAGE凝胶电泳60
• 4.3.4 多酚氧化酶酶学性质的研究60-61
• 4.3.4.1 反应进程曲线60-61
• 4.3.4.2 最适pH值61
• 4.3.4.3 最适温度61
• 4.3.4.4 最适底物浓度61
• 4.3.4.5 金属离子对多酚氧化酶的影响61
• 4.4 结果与分析61-67
• 4.4.1 硫酸铵分级沉淀的确定61-62
• 4.4.2 DEAE-纤维素阴离子交换层析62
• 4.4.3 葡聚糖G-150凝胶柱层析62-63
• 4.4.4 多酚氧化酶各步纯化结果63-64
• 4.4.5 多酚氧化酶催化反应的进程曲线64-65
• 4.4.6 多酚氧化酶的最适pH65
• 4.4.7 多酚氧化酶的最适温度65-66
• 4.4.8 底物浓度对酶活力的影响66
• 4.4.9 金属离子对多酚氧化酶活性的影响66-67
• 4.5 小结与讨论67-70
• 第五章 菌株CSN-13多酚氧化酶对茶多酚生物转化的初步研究70-82
• 5.1 前言70
• 5.2 材料70-72
• 5.2.1 菌种70
• 5.2.2 主要药品及设备70-71
• 5.2.3 培养基及试剂的配制71-72
• 5.3 方法72-73
• 5.3.1 茶多酚对菌株CSN-13生长的影响72
• 5.3.2 菌株CSN-13发酵液对茶汤的“转化”作用72
• 5.3.3 HPLC分析72-73
• 5.3.4 菌株CSN-13在固体培养基上培养及优化73
• 5.4 结果与分析73-79
• 5.4.1 茶多酚对菌株CSN-13生长的影响73
• 5.4.2 菌株CSN-13粗酶液对茶汤的“转化”作用73-74
• 5.4.3 粗酶液转化茶多酚的HPLC分析74-77
• 5.4.4 菌株CSN-13在固体培养基上培养以及优化77-78
• 5.4.5 固体发酵所产粗酶液对茶多酚的转化效果78-79
• 5.5 小结与讨论79-82
• 第六章 结论与展望82-86
• 6.1 结论82-83
• 6.2 问题及展望83-86
• 参考文献86-94
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果94-96
• 致谢96-98
• 索引98-100
• 个人简历100-104

【参考文献】

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本文编号：697854