拟南芥IAA1的原核表达载体构建及蛋白质表达与纯化

发布时间：2017-09-04 19:08

  本文关键词：拟南芥IAA1的原核表达载体构建及蛋白质表达与纯化

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【摘要】：植物激素是植物体内合成的一系列微量有机化合物,对植物的生长发育和环境应答具有重要的作用,植物激素在植物体内含量极低,易分解和氧化,其超微定量是制约植物激素研究的瓶颈之一,利用植物激素信号途径中能与之高亲和结合的响应因子创建某一激素的特异分离纯化方法可能是解决该问题的有效途径。因此,本研究从拟南芥获得生长素抑制蛋白基因IAA1的编码序列,以pGEX-KG为基本骨架构建IAA1原核表达载体,优化IAA1在三种大肠杆菌中表达条件,获得大量的IAA1重组蛋白为构建一种高效的生长素分离纯化方法奠定基础。主要试验结果如下：(1)获得了IAA1基因的扩增产物。以野生拟南芥为材料,提取拟南芥总RNA,反转录成cDNA,根据GeneBan数据库中公布的IAAlcDNA序列设计引物,以cDNA为模板,获得IAA1基因片段。(2)构建了IAA1原核表达载体。将IAAl基因与T载体连接,经过质粒PCR鉴定和双酶切鉴定筛选出阳性克隆,结果测序比对,确认获得正确的IAA1基因。连接质粒pGEX-KG后,转入DH5a大肠杆菌感受态细胞中,经过质粒PCR鉴定和双酶切鉴定筛选出阳性重组子。(3)确定了IAA1蛋白质的最佳表达菌株。将构建好的pGEX-KG-IAA1重组表达载体转入三种不同的表达菌株细胞中,加入异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,结果表明,Rosetta (DE3)为IAA1蛋白质的最佳表达菌株。(4)确定了IAA1蛋白最佳诱导温度。设定不同诱导温度对不同诱导温度条件下的总量样、上清样和结合样进行蛋白质电泳分析,结果表明,IAA1蛋白的最佳诱导温度为25℃。(5)获得了IAA1蛋白最佳诱导剂浓度。结果表明,IAA1蛋白的最佳诱导剂浓度为06mmol/L。
【关键词】：拟南芥 生长素抑制蛋白 重组蛋白 原核表达 蛋白纯化
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1 绪论9-16
• 1.1 研究背景和意义9-10
• 1.2 国内外研究进展10-15
• 1.2.1 生长素及其调控的分子机理10-12
• 1.2.2 能与生长素结合的蛋白12-13
• 1.2.3 生长素抑制蛋白Aux/IAA13-14
• 1.2.4 蛋白质的重组表达14-15
• 1.3 本研究的总体思路15-16
• 2 材料与方法16-26
• 2.1 材料16
• 2.1.1 植物材料16
• 2.1.2 质粒和菌株16
• 2.1.3 主要试剂16
• 2.1.4 主要仪器设备16
• 2.2 试验方法16-26
• 2.2.1 生物信息学分析16-17
• 2.2.2 IAA1基因的克隆17-20
• 2.2.3 拟南芥IAA1原核表达载体的构建20-23
• 2.2.4 IAA1蛋白质的诱导表达23-26
• 3 结果与分析26-41
• 3.1 生物信息学分析26-29
• 3.1.1 IAA蛋白的基本性质26-27
• 3.1.2 IAA蛋白的疏水性27
• 3.1.3 IAA1蛋白的信号肽分析27-28
• 3.1.4 IAA蛋白的二级结构预测28-29
• 3.2 IAA1的原核表达载体构建29-32
• 3.2.1 拟南芥总RNA的提取及IAA1基因的扩增29-30
• 3.2.2 IAA1基因T载体克隆的酶切鉴定30-31
• 3.2.3 原核表达载体pGEX-KG的酶切鉴31-32
• 3.3 IAA1蛋白表达条件的优化32-41
• 3.3.1 IAA在不同菌株中的表达32-35
• 3.3.2 最佳诱导温度的确定35-37
• 3.3.3 最佳诱导剂浓度的确定37-41
• 4 讨论41-43
• 全文总结及后续研究设想43-45
• 参考文献45-51
• 致谢51-52
• 作者简历52

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