谷胱甘肽亲和层析介质制备及其对蛋白的纯化

发布时间：2017-09-12 04:24

  本文关键词：谷胱甘肽亲和层析介质制备及其对蛋白的纯化

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【摘要】：谷胱甘肽-S-转移酶融合表达系统是通过大肠杆菌进行蛋白表达、纯化和检测的重要系统。此系统表达的蛋白一般在N末端融合上可溶性谷胱甘肽-S-转移酶作为标签。由于谷胱甘肽-S-转移酶与谷胱甘肽能够特异性的结合,因此可以通过谷胱甘肽亲和层析介质对谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白进行分离、富集和纯化。以琼脂糖凝胶4 FF为基质,1,4-丁二醇二缩水甘油醚为活化剂,通过活化、偶联谷胱甘肽(GSH),优化活化及偶联条件,得到GSH亲和层析介质。实验结果表明：活化及偶联的优化条件为10 mL基质加入0.42gNaOH,15mLDMSO,15mLBDGE,反应温度为40℃,反应时间为6 h。在此条件下,环氧基修饰密度可达60-65 μmol/mL;当偶联溶液pH 6.5时,所制备的自制介质载量可达14.19±0.98 mg/mL。以此介质对谷胱甘肽-S-转移酶及融合蛋白进行纯化,结果表明该介质纯化效果较好、稳定性较搞,可重复使用。丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase, EC 1.4.1.1)是一种以烟酰胺腺嘌呤(NAD+)为辅酶的氨基酸脱氢酶,可逆催化丙氨酸的氧化脱氨反应生成丙酮酸,氨以及NADH。晶体结构解析酶蛋白空间结构为深入阐述酶的催化机理提供更为有利的条件。本文以巨大芽孢杆菌WSH-002菌株(Bacillus. Megaterium WSH-002,GenBankNo.345442329)基因组为模版,将目的基因克隆到表达载体,得到重组质粒pET-28a-Ald、 pGEX-6P-1/Ald,并分别转入到BL21(DE3), IPTG低温诱导后均为大量可溶性表达。菌体上清液分别经商业镍柱、自制GSH层析柱和尺寸排除色谱纯化后均获得高纯度的Ald WSH-002蛋白。对高纯度蛋白采用晶体生长试剂盒筛选初步结晶条件并优化。蛋白浓度为12 mg/mL,结晶溶液为0.03 M柠檬酸pH7.5,16%(w/v) PEG3350时,晶体衍射率为2.22A属于三方晶系；蛋白浓度15 mg/mL,结晶溶液为0.1M HEPES pH 8.0,12%(w/v) PEG 8000,8%(v/v) ethylene glycol,晶体衍射率为2.35A,属三方晶系。
【关键词】：谷胱甘肽亲和层析 活化 载量 巨大芽孢杆菌WSH-002 丙氨酸脱氢酶 蛋白结晶 晶体结构
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q503
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-9
• 1 前言9-21
• 1.1 亲和层析介质9
• 1.2 谷胱甘肽亲和层析介质的特点9-10
• 1.3 谷胱甘肽亲和层析介质的研究进展10-11
• 1.4 丙氨酸脱氢酶的分布11
• 1.5 丙氨酸脱氢酶的生物学功能11-12
• 1.6 丙氨酸脱氢酶的催化机理12-13
• 1.7 丙氨酸脱氢酶的结构研究13-19
• 1.7.1 蛋白的表达13-14
• 1.7.2 蛋白的纯化14-15
• 1.7.3 蛋白晶体的获得15-18
• 1.7.4 晶体数据收集与处理18-19
• 1.7.5 丙氨酸脱氢酶的研究进展19
• 1.8 论文立题的背景,内容及意义19-21
• 1.8.1 论文立题背景19-20
• 1.8.2 研究内容及意义20-21
• 2 材料与方法21-39
• 2.1 实验材料21-28
• 2.1.1 实验常用生化试剂21-22
• 2.1.2 实验仪器22-23
• 2.1.3 试剂盒、工具酶及分子量Marker23-24
• 2.1.4 缓冲液和常用培养基的配制24-27
• 2.1.5 丙氨酸脱氢酶基因及其他菌株来源27-28
• 2.1.6 表达宿主和载体28
• 2.2 实验方法28-39
• 2.2.1 琼脂糖4 FF凝胶颗粒的活化28-29
• 2.2.2 活化的Sepharose 4 Fast Flow凝胶颗粒偶联GSH29
• 2.2.3 终止偶联反应29
• 2.2.4 谷胱甘肽亲和层析介质的性能评价29-30
• 2.2.5 丙氨酸脱氢酶重组质粒的构建30-35
• 2.2.6 丙氨酸脱氢酶的表达纯化35-37
• 2.2.7 丙氨酸脱氢酶结晶条件的初筛及优化37
• 2.2.8 丙氨酸脱氢酶蛋白晶体数据收集与处理37-39
• 3 结果与讨论39-56
• 3.1 琼脂糖凝胶活化条件的优化39-41
• 3.1.1 无水反应体系对活化的影响39
• 3.1.2 温度对活化的影响39-40
• 3.1.3 NaOH浓度对活化的影响40
• 3.1.4 活化时间的影响40-41
• 3.2 GSH偶联的优化41-42
• 3.3 GSH层析介质性能42-45
• 3.3.1 稳定性测试42-43
• 3.3.2 载量测试43-45
• 3.3.3 与GE介质层析效果对照45
• 3.4 丙氨酸脱氢酶Ald_WSH-002重组质粒的构建45-47
• 3.4.1 PCR扩增产物的鉴定45-46
• 3.4.2 Ald_BM WSH-002重组质粒的鉴定46-47
• 3.4.3 Ald_WSH-002重组质粒测序结果47
• 3.5 丙氨酸脱氢酶Ald_WSH-002的表达纯化47-50
• 3.5.1 试表达47-48
• 3.5.2 扩大化表达及纯化48-50
• 3.6 丙氨酸脱氢酶Ald_WSH-002结晶条件的筛选及优化50-51
• 3.6.1 蛋白结晶条件的初步筛选50
• 3.6.2 蛋白晶体的优化50-51
• 3.7 丙氨酸脱氢酶Ald_WSH-002蛋白晶体衍射数据收集与处理51-53
• 3.8 丙氨酸脱氢酶Ald_WSH-002蛋白的结构解析53-56
• 3.8.1 Ald_WSH-002蛋白的结构53
• 3.8.2 与其他丙氨酸脱氢酶氨基酸序列比对及结构比较53-54
• 3.8.3 Ald蛋白活性区域54-56
• 4 结论56-57
• 5 展望57-58
• 6 参考文献58-64
• 7 攻读硕士学位期间发表的论文64-65
• 8 致谢65-66
• 附录66-67

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