1型鸭甲肝病毒VP2和VP4蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2017-09-17 02:36

  本文关键词：1型鸭甲肝病毒VP2和VP4蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

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【摘要】：鸭甲肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus,DHAV)能引起雏鸭爆发鸭病毒性肝炎,其具有发病急、病程短、传播迅速、病死率高等特点,临床上主要表现为食欲减退、神经症状、突然死亡和肝脏肿大出血,又称歪脖病。目前几乎遍布世界各个养鸭国家和地区,给养鸭业带来了较大的经济损失。DHAV可分为DHAV-1、 DHAV-2和DHAV-3三个基因型。本研究主要针对DHAV-1的VP2. VP4基因分别进行了分子特性分析、原核表达和基于两种蛋白的间接ELISA检测方法的建立等研究,主要结果如下：1.Ⅰ型鸭甲肝病毒VP2、VP4基因的生物信息学分析和原核表达根据本试验室GenBank中提交的1型鸭甲肝病毒H株(登录号JQ301467.1)序列及专业的蛋白的切割位点预测软件NetPicoRna V1.0分析获得DHAV-H VP2、VP4基因序列,大小分别为543bp.225bp,分别编码181、75个氨基酸,分子量分别约为20.6KDa和7.7 kDa,VP2、VP4分别含有4个和1个N-豆蔻酰化位点、3个和1个N-糖基化位点、均含有3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,抗原位点较多。经RT-PCR扩增、T克隆和亚克隆,成功构建了原核表达重组质粒pProEx-HTb-VP2和pET32c(+)-VP4,分别转化到宿主菌BL21,经表达条件优化,得出在37℃、0.2mmol/L IPTG诱导8h,VP2重组蛋白可在宿主菌中以包涵体形式大量表达,经切胶纯化得到较纯的VP2重组蛋白。在37℃、0.6mmol/L IPTG诱导4h,VP4重组蛋白可在宿主菌中以可溶性形式表达,经Ni2+NTA柱纯化得到纯度较高的VP4重组蛋白。两种重组蛋白均与能被兔抗DHAV-1血清识别,具有很好的反应原性。2.基于VP2、VP4重组蛋白Ⅰ型鸭甲肝病毒的ELISA方法的建立分别以纯化的VP2、VP4重组蛋白为包被抗原并对包被条件、封闭条件、血清孵育条件、酶标抗体孵育条件及显色时间等的优化,分别建立了基于VP2、VP4重组蛋白的ELISA检测方法。结果显示,以VP2重组蛋白为包被抗原的ELISA最优检测条件为：以2.713μg/ml (100μl)的VP2重组蛋白4℃包被过夜,以5%脱脂奶粉作为封闭液37。C封闭1h,血清1：40稀释于37℃孵育2 h,HRP标记的兔抗鸭IgG以1：2000稀释于37℃孵育2h,TMB显色10 min为最佳检测条件,确定的阳性阈值为0.359。以VP4重组蛋白为包被抗原的ELISA最优检测条件为：以3.375μg/ml (100μl的VP4重组蛋白37℃3h后4℃过夜包被,以1%脱脂奶粉作为封闭液37℃封闭1h,血清1：80稀释于37℃孵育2h,HRP标记的羊抗鸭IgG以1：1600稀释于37℃孵育0.5 h,TMB显色30 min为最佳检测条件,确定的阳性阈值为0.203。建立的两种ELISA方法具有良好的特异性、重复性及灵敏度,与Ⅰ型鸭甲肝病毒为包被抗原的ELISA检测方法的符合率较高,分别为91.1%和70.5%,可用于DHAV-1血清抗体的检测。
【关键词】：Ⅰ型鸭甲肝病毒 VP2和VP4基因原核表达 间接ELISA方法建立
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩略词及符号表8-11
• 一 引言11-15
• 1 小RNA病毒VP2、VP4蛋白的研究进展11-13
• 1.1 小RNA病毒概述11
• 1.2 小RNA病毒VP211-12
• 1.3 小RNA病毒VP412-13
• 2 鸭病毒性肝炎的概述13-14
• 3 1型鸭甲肝病毒血清抗体诊断方法14-15
• 4 选题的目的及意义15
• 二 试验研究15-54
• 1 试验材料15-18
• 1.1 毒株、菌种及鸭胚15
• 1.2 主要试剂15-16
• 1.3 主要溶液的配制16-17
• 1.3.1 基因克隆、表达相关试剂16-17
• 1.3.2 Western-blot、蛋白质纯化相关试剂的配制17
• 1.3.3 ELISA相关溶液的配制17
• 1.4 主要仪器17-18
• 2 方法18-29
• 2.1 VP2、VP4基因的克隆、表达18-26
• 2.1.1 引物设计18-19
• 2.1.2 VP2、VP4基因及蛋白的生物信息学分析19
• 2.1.3 DHAV-1病毒增殖及基因组RNA的提取19
• 2.1.4 VP2、VP4基因的RT-PCR扩增19-20
• 2.1.5 VP2、VP4基因的克隆20-21
• 2.1.6 VP2、VP4基因重组原核表达质粒的构建及鉴定21-23
• 2.1.7 重组蛋白VP2、VP4的诱导表达及条件优化23-24
• 2.1.8 重组蛋白VP2、VP4的鉴定及纯化24-26
• 2.2 基于VP2、VP4蛋白间接ELISA检测方法的建立26-29
• 2.2.1 间接ELISA的基本操作程序26
• 2.2.2 抗原的最佳包被浓度和阴阳性血清最佳稀释度的确定26-27
• 2.2.3 酶标二抗最佳工作浓度的确定27
• 2.2.4 最佳包被条件27
• 2.2.5 最佳封闭条件确定27
• 2.2.6 血清及酶标二抗孵育时间确定27
• 2.2.7 显色时间确定27-28
• 2.2.8 阴阳性临界值的确定28
• 2.2.9 重复性试验28
• 2.2.10 特异性试验28
• 2.2.11 ELISA方法敏感性检测28
• 2.2.12 基于VP2、VP4蛋白ELISA检测方法的应用及与基于DHAV-1的ELISA方法符合率计算28-29
• 3 试验结果29-49
• 3.1 VP2、VP4基因的克隆、表达29-37
• 3.1.1 VP2、VP4的生物信息学分析29-32
• 3.1.2 VP2、VP4基因的扩增和克隆32-33
• 3.1.3 原核表达重组质粒的构建与鉴定33-34
• 3.1.4 VP2、VP4重组蛋白的诱导表达及条件优化34-36
• 3.1.5 VP2、VP4重组蛋白的鉴定与纯化36-37
• 3.2 基于VP2、VP4蛋白的ELISA方法的建立37-49
• 3.2.1 抗原的最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定37-38
• 3.2.2 最佳酶标二抗稀释度38-39
• 3.2.3 最佳包被条件39
• 3.2.4 最佳封闭液选择39-40
• 3.2.5 封闭时间40-41
• 3.2.6 最佳血清孵育时间及最佳酶标二抗孵育时间41
• 3.2.7 显色时间41-42
• 3.2.8 阴阳性临界值的确定42-43
• 3.2.9 重复性试验43-44
• 3.2.10 特异性检验44-46
• 3.2.11 敏感性检测46-47
• 3.2.12 基于VP2、VP4蛋白ELISA检测方法的应用及与基于DHAV-1的ELISA方法符合率计算47-49
• 4 讨论49-54
• 4.1 VP2、VP4基因的克隆表达49-51
• 4.2 基于VP2、VP4蛋白间接ELISA检测方法的建立51-54
• 三 结论54-55
• 参考文献55-59
• 致谢59

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