双酚A单克隆抗体的研制及免疫学检测方法的研究

发布时间：2017-10-01 15:14

  本文关键词：双酚A单克隆抗体的研制及免疫学检测方法的研究

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【摘要】：双酚A是一种酚类雌激素,广泛用于水瓶、婴儿奶瓶、罐头瓶等食品和饮料容器。这些食品包装材料中微量的双酚A可以迁移到食品和周围环境中,通过食物链或生物链进入生物体内,对人和动物的健康造成威胁。本论文旨在建立酶联免疫吸附法,用于快速检测双酚A的残留。本研究以双酚A的结构类似物双酚酸为半抗原,采用碳二亚胺法将双酚酸分别偶联到KLH和OVA上,合成免疫抗原BVA-KLH和检测抗原BVA-OVA。紫外扫描光谱表明偶联成功。以BVA-KLH免疫BALB/c小鼠,采用PEG法将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞进行融合,成功筛选到2株分泌抗双酚A抗体的杂交瘤细胞1G3和3H1。杂交瘤细胞3H1分泌的抗体为IgG1亚型,轻链为κ。建立了双酚A的ELISA检测方法,最低检测限(IC10)为0.43ng/mL,检测范围为lng/mL～50ng/mL, IC50为6.56ng/mL。特异性实验表明,与双酚S、双酚酸、对苯二酚和邻羟基苯甲酸的交叉反应率的交叉反应率均小于1%。对塑料瓶装的矿泉水和人血清进行添加回收实验,回收率分别为82.83%-101.94%和70.1%～87.8%,变异系数分别为2.94%～12.95%和4.79%～9.41%。采用间接竞争ELISA法测定儿童血清中双酚A含量,176份血清样品中,95份可检出双酚A,检出率为54%。全部样品的双酚A的浓度范围为未检出-26.48ng/mL。男童检出率高于女童,检出率差异在不同年龄组间不明显。综合各因素,本研究制备了特异性较高的双酚A单克隆抗体,建立的ELISA方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于水样、人血清等样品的双酚A检测。
【关键词】：双酚A 单克隆抗体 抗原 竞争ELISA 血清
【学位授予单位】：江西科技师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q503
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 绪论11-23
• 1.1 双酚A概述11-16
• 1.1.1 双酚A的理化性质11-12
• 1.1.2 双酚A的用途12
• 1.1.3 双酚A的污染情况12-13
• 1.1.4 双酚A的危害性13-14
• 1.1.5 双酚A的残留限量标准14-15
• 1.1.6 双酚A的降解方法15-16
• 1.2 双酚A残留检测方法研究进展16-21
• 1.2.1 紫外分光光度法17
• 1.2.2 气相色谱法17-18
• 1.2.3 高效液相色谱法18
• 1.2.4 极谱法18-19
• 1.2.5 免疫分析法19-21
• 1.3 本课题的研究意义21-22
• 1.4 本课题的研究思路及内容22-23
• 第2章 双酚A人工抗原的合成与鉴定23-28
• 2.1 材料与仪器23-24
• 2.1.1 材料与试剂23
• 2.1.2 溶液配制23
• 2.1.3 仪器23-24
• 2.2 实验方法24-25
• 2.2.1 双酚A免疫抗原的合成24
• 2.2.2 双酚A检测抗原的合成24-25
• 2.2.3 双酚A人工抗原的鉴定25
• 2.3 结果与分析25-26
• 2.3.1 双酚A半抗原及完全抗原的紫外扫描结果25-26
• 2.4 讨论26-27
• 2.4.1 连接臂的选择26
• 2.4.2 载体的选择26-27
• 2.4.3 偶联方法的选择27
• 2.5 本章小结27-28
• 第3章 双酚A单克隆抗体的制备28-42
• 3.1 材料与仪器28-29
• 3.1.1 实验动物与细胞28
• 3.1.2 试剂和材料28-29
• 3.1.3 溶液配制29
• 3.1.4 仪器29
• 3.2 实验方法29-36
• 3.2.1 动物免疫29-30
• 3.2.2 抗血清效价测定30
• 3.2.3 抗双酚A多克隆抗体的特异性测定30-31
• 3.2.4 细胞融合31-33
• 3.2.5 杂交瘤细胞的筛选33-34
• 3.2.6 杂交瘤细胞的克隆化34-35
• 3.2.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏35
• 3.2.8 单克隆抗体的大量生产35
• 3.2.9 单克隆抗体腹水的纯化35-36
• 3.2.10 单克隆抗体蛋白含量的测定36
• 3.2.11 抗体亚型的鉴定36
• 3.3 结果与分析36-39
• 3.3.1 免疫血清效价及特异性的测定36-37
• 3.3.2 细胞融合37
• 3.3.3 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆37-38
• 3.3.4 注射杂交瘤细胞的小鼠形态变化38-39
• 3.3.5 单克隆抗体蛋白含量的确定39
• 3.3.6 抗体亚型的鉴定39
• 3.4 讨论39-41
• 3.4.1 细胞融合39-40
• 3.4.2 杂交瘤细胞的筛选及克隆40
• 3.4.3 腹水的纯化40-41
• 3.5 本章小结41-42
• 第4章 双酚A免疫学检测方法的建立及应用42-60
• 4.1 材料与仪器42-43
• 4.1.1 试剂和材料42-43
• 4.1.2 溶液配制43
• 4.1.3 仪器43
• 4.2 实验方法43-48
• 4.2.1 检测抗原包被浓度及抗体稀释度的确定43-44
• 4.2.2 间接竞争ELISA操作步骤44
• 4.2.3 双酚A标准品稀释液的优化44-45
• 4.2.4 抗体稀释缓冲液pH值的优化45
• 4.2.5 ELISA标准工作曲线的建立及检测限的确定45
• 4.2.6 抗体特异性的测定45
• 4.2.7 塑料瓶装矿泉水双酚A加标回收实验45-46
• 4.2.8 间接ELISA法测定儿童血清中双酚A含量46-47
• 4.2.9 高效液相色谱(HPLC)法47-48
• 4.3 结果与分析48-58
• 4.3.1 检测抗原包被浓度及抗体稀释度的确定48-49
• 4.3.2 双酚A标准品稀释液的优化49-50
• 4.3.3 抗体稀释缓冲液pH值的优化50
• 4.3.4 ELISA标准工作曲线的建立及检测限的确定50-51
• 4.3.5 抗体特异性的测定51-52
• 4.3.6 塑料瓶装矿泉水双酚A加标回收实验52
• 4.3.7 间接ELISA法测定儿童血清中双酚A含量52-55
• 4.3.8 高效液相色谱(HPLC)法55-58
• 4.4 讨论58
• 4.5 本章小结58-60
• 第5章 结论与展望60-61
• 参考文献61-67
• 攻读学位期间的研究成果67-68
• 致谢68

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本文编号：954157