玉米抗旱miRNAs及其靶基因的发掘与功能验证

发布时间：2017-12-12 16:15

  本文关键词：玉米抗旱miRNAs及其靶基因的发掘与功能验证

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【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一类非编码的内源小RNA分子,在生物体的生命活动中起着重要的调控作用。miRNAs通过调控靶基因的表达来参与生物体的生长发育、分化增殖和细胞凋亡等生物学过程。现在对于植物miRNA的研究仍然以拟南芥、水稻等模式植物为主,但是在其他一些植物中仍然有大量的物种特异的miRNA没有被发现。玉米是全世界种植最广泛的作物,同时也是重要的粮食作物之一,而干旱是限制玉米产量的主要因素之一,抗旱育种一直是研究者们重要的育种目标,因此通过耐旱miRNA的鉴定来挖掘抗旱相关功能基因不仅有助于深入理解玉米抗旱机制,而且对培育玉米抗旱新品种提供有效途径。本研究通过利用高通量测序技术鉴定两个玉米自交系中差异表达显著的新miRNAs,并对差异表达显著的新miRNAs进行分析和靶基因的预测,在此基础上利用转基因方法过量表达miRNA的靶基因来进行功能鉴定和作用机制分析。获得如下主要结果:1、通过高通量测序技术总共鉴定了192个玉米miRNAs,包括124个已知的miRNAs和68个新的miRNAs。68个新的miRNAs中有18个miRNAs的序列频率极低并且长度超过24 nt,茎环引物荧光定量PCR反应结果显示14个miRNAs在两个玉米自交系中检测到表达量。2、对鉴定的192个玉米miRNAs进行筛选得到了29个在两个玉米自交系中差异显著性表达的miRNAs,包括18个下调miRNAs和11个上调miRNAs,其中有5个新的miRNAs:PC-3p-190,PC-3p-104764,PC-3p-129630,PC-3p-552502和PC-5p-139812。对这5个新miRNAs进行靶基因的预测和GO注释分析,发现预测的9个靶基因中,7个靶基因的GO注释可以划分为21个生物学过程,包括固碳作用、光合作用、蛋白水解作用等,而另外两个靶基因没有预测到任何生物学功能。此外,5个miRNAs中有4个miRNAs拥有共同的靶基因(GRMZM2G448344),PC-3p-104764和PC-3p-129630也拥有共同的靶基因(GRMZM2G360821 and GRMZM2G308907),且这些靶基因都参与光合作用。3、根据已公布的玉米18个组织的RNA-Seq转录组数据对9个靶基因进行表达模式的分析,结果显示9个靶基因具有不同的表达模式,但是都只在叶片中表达,其中GRMZM2G360821和GRMZM2G308907的表达水平最高,说明这些靶基因可能在植物的光合作用中扮演着重要的角色,而这与上述靶基因的GO注释分析结果相一致。4、通过Stem-loop RT-PCR方法检测到ZmmiR139的表达量与其靶基因ZmDST44的表达量呈现负相关性,初步验证ZmDST44是ZmmiR139的靶基因;然后利用5'RACE方法验证ZmmiR139对ZmDST44的剪切作用,通过测序得到有41个测序结果正确且其剪切位点为同一位置。因此,通过Stem-loop RT-PCR及5’-RACE实验验证了ZmmiR139及其靶基因ZmDST44之间的相互作用。5、过量表达ZmDST44的转基因拟南芥和野生型拟南芥在正常条件下的生长表型没有明显差异,而干旱胁迫条件下,转基因拟南芥相对于野生型具有明显的抗旱表型;通过测定野生型植株和转基因植株在PEG 6000处理下的萌发率和在干旱胁迫条件下的丙二醛含量,发现转基因植株在PEG 6000处理下的萌发率显著高于野生型植株,四个转基因株系在干旱胁迫条件下的丙二醛含量均显著低于野生型植株,说明过量表达ZmDST44能够显著提高转基因拟南芥的耐旱性。6、过量表达ZmDST44的转基因水稻和野生型水稻在正常条件下的生长表型没有明显差异,而干旱胁迫条件下,转基因水稻相对于野生型具有明显的抗旱表型。此外,在干旱胁迫过程中,转基因水稻的叶片相对含水量显著高于野生型植株,表明过量表达ZmDST44可以提高植株在干旱胁迫条件下的保水能力。复水试验结果显示,转基因株系的存活率显著高于野生型株系。结合以上结果,说明过量表达ZmDST44基因能够显著提高转基因水稻的抗旱能力。综上所述,本研究通过发掘玉米抗旱新miRNA来发掘抗旱相关功能基因,通过分子生物学实验方法验证了ZmmiR139及其靶基因ZmDST44之间的相互作用,最后利用转基因方法验证了过量表达ZmDST44基因可以提高转基因水稻和拟南芥的耐旱性。本项研究的结果不仅为利用基因工程方法改良作物的抗逆性提供了优良的基因资源,而且为玉米抗旱分子机制的解析奠定基础。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S513;Q943.2

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