乳酸菌的生长抑制和冻干存活的影响因素及规律

发布时间：2017-12-14 06:49

  本文关键词：乳酸菌的生长抑制和冻干存活的影响因素及规律

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【摘要】：乳酸菌因其良好的发酵性能及优越的益生特性深受青睐,为提高乳酸菌的培养浓度及菌剂的制备效率需明确乳酸菌的生长抑制因素及影响冻干存活的关键工艺控制点。本文系统研究了不同同型发酵乳杆菌和双歧杆菌生长的主要抑制因素,并归纳分析了两种发酵类型的菌株最高生物量的规律;然后基于生长抑制规律提出了离子交换高密度培养法,研究了该方法对菌株生长的影响;最后分析菌剂制备时菌泥与保护剂混合过程中的产酸情况及其对冻干存活的影响。主要研究结果如下:系统分析不同同型发酵乳杆菌分批培养和恒pH(7.0)补料分批培养至最高生物量时代谢产物积累与底物消耗,发现两种培养方式均不存在底物抑制,低pH值和有机酸的积累是分批培养抑制乳杆菌生长的主要因素。通过测定乳酸钠、乙酸钠和氯化钠在中性时对不同同型发酵乳杆菌的最低抑菌浓度,发现除鼠李糖乳杆菌外,酸根对植物乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌及嗜酸乳杆菌的最低抑菌浓度与氯化钠的最低抑菌浓度相同;且恒pH(7.0)补料分批培养完全抑制菌株生长时乳酸根积累浓度与乳酸根在中性时对乳杆菌的最低抑菌浓度无显著差异,菌株被完全抑制时发酵液的渗透压与添加最低抑菌浓度乳酸钠的培养基的渗透压无显著差异。结果表明,胞外酸根积累引起的渗透压升高是恒pH(7.0)补料分批培养抑制大部分同型发酵乳杆菌生长的主要因素,渗透压升高和酸根的毒害作用是鼠李糖乳杆菌的主要抑制因素。另外,分析乳酸菌酸根积累与产菌量的关系,发现所有的同型发酵乳杆菌在乳酸根积累至其对菌株的最低抑菌浓度时停止生长,不同同型发酵乳杆菌最高生物量(X_(max))与乳酸根对菌株的最低抑菌浓度(C)及分泌单位乳酸的产菌量(Y_(X/P))有关,同型发酵乳杆菌的最高生物量符合以下规律:X_(max)-X_0=(0.59±0.02)·Y_(X/P)·C。系统分析了两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、青春双歧杆菌及动物双歧杆菌等不同双歧杆菌分批培养和恒pH(7.0)补料分批培养的主要抑制因素,发现低pH值和有机酸的积累是分批培养抑制双歧杆菌生长的主要因素。乳酸根、乙酸根及混合酸根在中性时对双歧杆菌的最低抑菌浓度与氯化钠的最低抑菌浓度相同;恒pH(7.0)补料分批培养完全抑制菌株生长时总酸根积累浓度与酸根在中性时对双歧杆菌的最低抑菌浓度无显著差异,菌株被完全抑制时发酵液的渗透压与添加最低抑菌浓度酸根的培养基的渗透压无显著差异。结果表明,胞外酸根积累引起的渗透压升高是恒pH(7.0)补料分批培养抑制双歧杆菌生长的主要因素。另外,发现不同双歧杆菌的最高生物量(X_(max))同样具有规律性,其与酸根的最低抑菌浓度(C)及分泌单位酸根的产菌量(Y_(X/P))高度相关,双歧杆菌的最高生物量符合以下规律:X_(max)-X_0=(0.71±0.03)·Y_(X/P)·C。测定不同同型发酵乳杆菌和双歧杆菌生长期间葡萄糖代谢成酸的转化率,发现所有被测乳酸菌均将90%左右的葡萄糖转化成酸,由此将补料与补碱进行关联(关联比例为k:1,即补加1 m L碱液自动补加k m L补料培养基),补碱量即为产酸量,根据碱消耗及糖代谢成酸的转化率可知底物的消耗量,按照以下公式:C_碱/40×2×90%=C_碱/180?k(同型发酵乳杆菌);C_碱/40×5×90%=C_碱/180×2?k(双歧杆菌)配制碱液浓度和补料培养基葡萄糖浓度,根据碱自动反馈补料时,底物的补加遵循消耗规律,确保了培养体系底物的稳定性。恒pH(7.0)补料分批培养植物乳杆菌CCFM 8610,以渗透压作为唯一抑制因素拟合其生长动力学,得到方程:μ=(0.96±0.09)×(1-(O-(336±1)/(2416±97)-(336±1))~ (0.25±0.04))。该动力学表明菌株对渗透压比较敏感,在渗透压升高时生长速率快速降低;随着渗透压的继续升高,该菌株的生长速率缓慢降低。通过测定不同阴离子交换树脂在37℃时对乳酸根的吸附容量及对葡萄糖和氨基酸的选择性,筛选得到最优的阴离子交换树脂D319。将其转型为OH~-应用到自主设计的离子交换生物反应器中高密度培养植物乳杆菌CCFM 8610。结果表明,酸根选择性解除后,菌株能够继续增殖,其生长符合渗透压动力学方程,证实了酸根引起的渗透压升高是植物乳杆菌恒pH(7.0)补料分批培养的主要抑制因素。该离子交换生物反应器为提高乳酸菌的生长浓度提供了新培养方法,利用此系统培养植物乳杆菌CCFM 8610,12 h后细胞干重达到34.5 g/L,分别是分批培养的13.3倍,恒pH(7.0)补料分批培养的3.3倍。真空冷冻干燥是乳酸菌菌粉制备的关键技术手段,在冻干前须将菌泥与保护剂混匀并进行预冻。系统研究菌泥与保护剂混匀过程中的代谢产酸情况,及产酸引起的pH值降低对冻干存活的影响。测定了不同乳酸菌添加保护剂后在室温和冷藏温度下的产酸速率,以及不同pH值条件下预冻及冻干后菌株的存活率,并分析了不同pH值条件下预冻和冻干对菌株ATP酶、β-半乳糖苷酶、乳酸脱氢酶及细胞膜完整性和流动性的影响。结果表明,菌泥与保护剂混合后,室温环境下会快速产酸引起菌悬液pH值的降低,影响乳酸菌的预冻和冻干存活。pH值降至4.0时,预冻阶段菌株的存活率出现显著降低,冻干结束后存活率进一步降低;pH值降至5.0时,菌株在预冻阶段的存活率未受到影响,但冻干结束后存活率显著降低。低pH环境下菌株预冻和冻干存活率的降低归因于酸加重了预冻及冻干过程引起的乳酸菌ATP酶和β-半乳糖苷酶的损伤及细胞膜流动性的降低。通过分析保护剂的量与能够保护的不同乳杆菌最多的菌泥湿重(m)、总菌数量(N)、菌株细胞膜总表面积(S_t)、菌株总体积(V_t)的关系,发现即使菌种不同,但是菌株的细胞膜总表面积与保护剂的量高度相关。保护剂的量与不同乳杆菌细胞膜的总表面积符合以下规律:N·(4πr~2+2πl)=(0.66±0.03)·M,根据此规律可推断冻干前保护剂的最适添加量。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS201.3

【参考文献】

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本文编号：1286899