白蜡虫低温适应分子机制及抗冻蛋白功能研究

发布时间：2017-12-14 06:52

  本文关键词：白蜡虫低温适应分子机制及抗冻蛋白功能研究

  更多相关文章： 白蜡虫 抗冻 转录组 蛋白组 差异表达基因 抗冻蛋白 热滞活性

【摘要】：长春越冬白蜡虫雌成虫能够忍耐-30℃以下的极端低温,能够在东北的极端低温环境下越冬并繁殖后代。白蜡虫对低温的适应性与自然种群分布关系极为密切,为了探讨白蜡虫的低温适应机制,本研究采用高通量测序、荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q-RT-PCR)检测、基因克隆、原核表达、植物转基因等方法,分析了长春越冬白蜡虫雌成虫的转录组、蛋白组、与昆明越冬前白蜡虫雌成虫基因表达差异、抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)候选基因周年表达动态、afp候选基因序列特征、基因功能等,阐述了白蜡虫适应极端低温可能的分子机制,并从中挖掘到新型昆虫afp基因。获得的主要研究结果如下:(1)通过Illumina转录组测序,获得54,934,590条raw reads,拼接后获得161,005个转录本(transcript),预测有11,871个编码序列(coding sequence,CDS)。在转录组中没有注释到抗冻蛋白。Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析表明,多数转录本富集在信号转导和代谢过程中,其中MAPK信号通路、钙离子信号通路、PI3K-Akt信号通路、可溶性糖、糖醇、游离氨基酸等的生物合成途径占优势,对于白蜡虫的低温适应性具有重要意义。(2)通过蛋白质全谱分析,获得了蜡虫在极端低温下的蛋白组数据,从中分离鉴定白蜡虫抗冻相关的蛋白,如脂肪酸脱氢酶(fatty acid desaturase,FAD)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)、脱水蛋白(dehydrin)、热激蛋白(heat shock protein,HSP)等。GO和KEGG分析表明,多数蛋白富集在信号转导和代谢过程中,其中PPAR信号通路、MAPK信号通路、钙离子信号通路占优势。采用random forest approach软件在蛋白组中成功预测到388个抗冻蛋白。(3)通过RNA-Seq测序(RNA Sequencing)技术对昆明越冬前白蜡虫雌成虫进行了表达谱测序,分析了长春越冬白蜡虫雌成虫和昆明越冬前白蜡虫雌成虫基因表达的差异,共鉴定到2,386个差异表达的基因,其中1,124个基因上调表达,1,262个基因下调表达,其中hsp70差异表达显著。这些差异表达基因主要参与糖代谢、精氨酸、脯氨酸代谢。(4)结合蛋白组和差异基因分析,以及random forest approach软件预测结果,共筛选出39个白蜡虫afp候选基因,进一步分析了这39个afp候选基因在长春和昆明白蜡虫中的周年表达动态,发现有10个afp候选基因的表达动态呈“山形”,符合afp基因的周年表达动态的特征。(5)对筛选出的10个白蜡虫afp候选基因,进行了基因编码框cDNA克隆,对获得的序列进行序列特征分析、三级结构预测和系统进化分析,生物信息学分析结果表明,预测的10个白蜡虫afp候选基因具有AFP的序列和结构特点。(6)对这10个白蜡虫afp候选基因,利用同源重组构建了原核表达载体,转化大肠杆菌BL21。采用IPTG诱导,成功表达了1个白蜡虫AFP,该蛋白在上清和菌体中均有表达,而且表达量大,蛋白具有活性,利用差示扫描量热法测得热滞活性为0.97℃。(7)对原核表达成功的afp基因进行植物表达载体构建,采用农杆菌介导的方法,将白蜡虫afp基因整合到烟草的基因组中,过冷却点(supercooling point,SCP)测试表明,转基因植株和野生型对照相差0.36℃,但统计结果表明两者的差异不显著。本研究针对长春地区白蜡虫越冬雌成虫可以抵御当地极端低温的生物学现象,初步阐述了白蜡虫低温适应可能的分子机制,并还挖掘了白蜡虫afp基因。该研究不但有助于了解白蜡虫低温适应性对其种群分布的影响,同时也有助于人们设计和生产出更多具有抗冻活性的分子。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S899.1

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本文编号：1286916