碳离子辐射诱变白花紫露草突变体叶色变化机理研究

发布时间：2017-12-23 08:43

本文关键词：碳离子辐射诱变白花紫露草突变体叶色变化机理研究　出处：《甘肃农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：叶色突变体是研究高等植物光合系统结构、叶绿素代谢、叶绿体发育、光合作用及激素生理等一系列生理代谢过程的理想材料,也是遗传和育种研究中的重要材料。本研究利用碳离子辐照技术,对野生型白花紫露草(Wild type,WT)幼嫩枝条进行辐照处理,并筛选得到可稳定遗传的温敏型叶色突变体(mutant,mt),该突变体的叶色随温度的降低由绿色逐渐变为粉色,随着温度升高粉色又逐渐褪去,直至变为深绿色。本研究以此突变体为材料,通过对不同温度环境下白花紫露草野生型和突变体表型观察、细胞水平检测、光合特性研究、色素成分分析以及花青素合成途径关键基因的差异表达分析,探讨白花紫露草叶色突变的物质基础和理化因素;利用RNA-Seq转录组测序技术对不同温度下的野生型和叶色突变体进行基因组分析,构建白花紫露草unigene库及公共信息平台,破译不同温度下对照与突变体的关键基因,预测温度变化引起突变体叶色变化的相关基因,探究因辐照引起的白花紫露草叶色随温度变化的代谢途径,阐明重离子诱导白花紫露草叶色随温度变化的机理,并为后续相关基因的功能验证以及重离子诱变选育叶色突变体提供理论基础。研究结果如下:(1)以不同剂量的碳离子束辐照白花紫露草幼嫩枝条后,在20Gy剂量下筛选到一株茎杆变为紫色、叶片随温度降低呈粉色斑块、且斑块大小与颜色深浅随温度发生变化的突变体。在不同温度环境下,mt的叶色、叶长、叶宽、叶面积以及叶片含水量等叶片参数较WT均发生了变化;经流式细胞仪对染色体数目进行鉴定分析发现,与WT相比,其染色体倍性并未发生改变。(2)对不同温度下的白花紫露草WT和mt的叶片解剖结构特征进行比较发现:在光学显微镜下,在7℃环境下,mt-7℃叶片的下表皮积累大量的紫色花青素,且在维管组织和海绵组织中也观察到少量的花青素积累;mt-25℃环境下,mt叶片中海绵组织和维管组织的花青素消失,仅叶片下表皮有少量的花青素分布;在WT中仅观察到大量的叶绿素,并未观察到其他色素成分。在扫描电镜下,不同温度环境下,mt叶片上表皮细胞形态差异不显著,但是下表皮分布的气孔差异显著。在透射电镜下,WT可以观察到成熟完整的叶绿体;mt-25℃叶片叶绿体结构模糊,随着温度的降低,mt-7℃叶片中白色体代替了叶绿体。(3)对不同温度环境下的mt叶片的色素含量、叶绿素荧光参数及光合作用关键酶进行了测定分析。结果表明:在7℃环境下,与WT相比,mt-7℃叶片中叶绿素含量和类胡萝卜素含量分别降低了45%和94%,花青素含量较WT增高了21倍;mt-7℃叶片的比活性参数ABS/RC、TRO/RC、ETO/RC均显著高于WT;FV/FM、PIABS、φEO以及φO均显著低于WT;除PEPCase外,其余两种光合作用的关键酶活性均显著低于野生型。随着温度的升高,mt-25℃叶片叶绿素含量和类胡萝卜素含量与WT之间无显著差异,但花青素含量升高了50%;在叶绿素荧光参数方面,mt-25℃的FV/FM和PIABS值显著低于WT外,其余各项参数指标与WT之间无显著差异;mt-25℃叶片的三种光合作用关键酶活性也随温度升高而增加。(4)利用HPLC对花青素和黄酮的成分和含量进行测定。在WT中未检测到任何花青素成分。与WT相比,在不同温度条件下,mt叶片中均检测到矢车菊素、矮牵牛素、飞燕草素三种花青素成分,天竺葵素仅在mt-7℃叶片中存在,但是在mt-25℃叶片中各花青素的含量均显著低于mt-7℃的含量,进一步证实了由于花青素含量的下降以及成分的变化引起其叶色恢复为绿色。(5)花青素合成途径关键基因的q RT-RCR结果显示,mt-7℃叶片中花青素合成途径的结构基因(PAL、CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS、UFGT、OMT)和转录因子(R2R3-MYB和WD40)的表达量均极显著高于WT;随着温度升高,mt-25℃结构基因PAL、CHS和ANS表达量下调,且与WT表达量差异不显著,这三种基因的下调,阻断了花青素的合成,是其叶色恢复为绿色的因素之一。(6)通过RNA-Seq转录组测序,获得了白花紫露草转录组unigenes数据库,测序共组装获得91565条unigenes,其中功能注释了44733条unigenes。WT较mt-7℃样品组、WT较mt-25℃样品组以及mt-25℃较mt-7℃样品组分别检测到15368、12401和6456条差异表达基因。KEGG pathway分析结果显示,差异基因主要集中在卟啉和叶绿素合成代谢途径、光合作用代谢、光合作用天线蛋白以及花青素合成途径。另外对7个花青素合成途径的unigenes和10个叶绿素合成途径的unigenes进行了q RT-PCR验证,其结果与RNA-Seq的数据一致,mt-7℃叶片中主要表现为花青素合成途径unigenes的表达量上调和叶绿素合成途径的unigenes表达量下调造成其叶色呈现粉色。而mt-25℃叶片中,部分叶绿素合成途径的unigenes表达量上调(如POR)以及花青素合成途径下游基因ANS表达量的上调造成其叶色较WT深,且背部呈现淡紫色。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q945

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