Atg5蛋白调控晚期胞内体和溶酶体的生成

发布时间:2017-06-14 18:13

  本文关键词:Atg5蛋白调控晚期胞内体和溶酶体的生成,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:细胞自噬是真核细胞一种依赖于溶酶体的降解途径,当细胞遇到各种形式的刺激时,自吞噬将降解细胞自身大分子、细胞器和一些错误折叠的蛋白以帮助细胞缓解应激,自吞噬过程在进化上高度保守。Atg5蛋白在自吞噬过程中起重要的作用,Atg5-Atg12结合系统在自噬体膜的弯曲并招募Atg8(LC3)上起重要作用。我们的研究发现Atg5蛋白同时也在溶酶体和晚期胞内体的形成过程中扮演重要的角色,而这一过程是非自吞噬依赖途径。我们发现,在Atg5基因缺失的细胞中,出现大量的溶酶体和晚期胞内体融合形成的杂交体,这是由于从杂交体抽离晚期胞内体成分的过程受到阻碍,进而晚期胞内体成分的再循环利用过程也被阻断,导致细胞内的杂交体大量滞留,溶酶体和晚期胞内体不能进行再生。我们同时在Atg7,Atg12,Atg9基因(自噬必需基因)缺失细胞中观察晚期胞内体和溶酶体,并不能观察到与Atg5基因缺失的相同现象。晚期胞内体从杂交体抽离这一过程是受环境中的酸碱度调控,而细胞中囊泡内酸性的维持依赖于囊泡上招募的V-ATPase。我们的研究表明,V1-ATPase并不能有效被招募到酸性囊泡上,这直接导致杂交体p H升高,晚期胞内体成分不能从杂交体顺利抽离,进而导致细胞内杂交体的大量滞留。当我们在Atg5基因缺失的细胞中人为降低细胞内的p H值时,受损的溶酶体和晚期胞内体再生过程得到修复,我们看到与WT细胞中类似的晚期胞内体和溶酶体结构。我们的研究阐明了Atg5除自吞噬外的其他作用,也即Atg5在溶酶体和晚期胞内体再生过程中发挥了重要作用。
【关键词】:晚期胞内体/溶酶体再生 Atg5 自吞噬
【学位授予单位】:清华大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q26
【目录】:
  • 摘要3-4
  • Abstract4-9
  • 英文缩略词对照表9-11
  • 第1章 引言11-34
  • 1.1 溶酶体、晚期胞内体生成机制概述11-29
  • 1.1.1 溶酶体概述11-12
  • 1.1.2 胞内体概述12
  • 1.1.3 溶酶体功能12-16
  • 1.1.4 溶酶体与疾病16-25
  • 1.1.5 溶酶体、晚期胞内体生成机制25-29
  • 1.2 Atg蛋白的研究进展29-34
  • 1.2.1 Atg蛋白的分类29-33
  • 1.2.2 Atg5蛋白的功能研究33-34
  • 第2章 材料与方法34-51
  • 2.1 试剂与抗体34-35
  • 2.1.1 抗体34
  • 2.1.2 试剂34-35
  • 2.2 细胞培养35-36
  • 2.3 细胞电转36
  • 2.4 Lentivirus病毒构建以及感染36-39
  • 2.5 质粒、Si RNA、Sh RNA信息39
  • 2.6 活细胞成像39
  • 2.7 细胞内吞囊泡提取39-40
  • 2.8 免疫荧光染色40-42
  • 2.9 透射电镜42
  • 2.10 显微镜图像分析42
  • 2.11 蛋白免疫印迹42-44
  • 2.12 RNA提纯及反转录PCR44-46
  • 2.13 表达质粒构建46-48
  • 2.14 单克隆稳定表达细胞系构建48-49
  • 2.15 胆固醇含量检测49-51
  • 第3章 Atg5缺失导致晚期胞内体和溶酶体再生缺陷51-59
  • 3.1 本章引论51
  • 3.2 实验结果51-58
  • 3.2.1 Atg5~(-/-) MEF细胞LPOs大小、数量和分布发生改变51-53
  • 3.2.2 导入外源Atg5至Atg5~(-/-) MEF细胞中LPOs大小、数量和分布恢复正常53-56
  • 3.2.3 Atg5敲低的大鼠肾上皮细胞( NRK)中LPOs数量、大小和分布改变56-58
  • 3.3 本章讨论与小结58-59
  • 第4章 Atg5以非自吞噬依赖的方式调控晚期胞内体和溶酶体再生59-68
  • 4.1 本章引论59-60
  • 4.2 实验结果60-67
  • 4.2.1 Atg7稳定敲低NRK细胞中晚期胞内体与溶酶体数量、大小和分布未见明显改变60-62
  • 4.2.2 Atg9稳定敲低NRK细胞中晚期胞内体与溶酶体数量、大小和分布未见明显改变62-64
  • 4.2.3 Atg12稳定敲低NRK细胞中晚期胞内体与溶酶体数量、大小和分布未见明显改变64-67
  • 4.3 本章讨论与小结67-68
  • 第5章 Atg5缺失将导致晚期胞内体和溶酶体再生停留在杂交体68-79
  • 5.1 本章引论68-69
  • 5.2 实验结果69-78
  • 5.2.1 利用不同标记物可以显示WT MEF细胞中晚期胞内体、溶酶体和杂交体69-72
  • 5.2.2 在Atg5~(-/-) MEF细胞中缺少晚期胞内体72-73
  • 5.2.3 在Atg5~(-/-) MEF细胞中LPOs是晚期胞内体 -溶酶体的杂交体73-78
  • 5.3 本章讨论与小结78-79
  • 第6章 Atg5缺失导致晚期胞内体长管及长管调节的分裂过程受损79-84
  • 6.1 本章引论79
  • 6.2 实验结果79-83
  • 6.2.1 Atg5缺失导致晚期胞内体长管和长管调控的分裂过程受损79-81
  • 6.2.2 新生成的LPOs来源于晚期胞内体 -溶酶体的杂交体81-82
  • 6.2.3 新生成的LPOs可与早期胞内体融合82-83
  • 6.3 本章讨论与小结83-84
  • 第7章 Atg5缺失导致晚期胞内体成分从杂交体中分离障碍84-88
  • 7.1 本章引论84
  • 7.2 实验结果84-87
  • 7.2.1 SNX1在Atg5缺失细胞中形成增大的点状结构84-86
  • 7.2.2 Atg5缺失导致由Retromer调控的晚期胞内体成分从杂交体分离过程障碍86-87
  • 7.3 本章讨论与小结87-88
  • 第8章 Atg5缺失导致杂交体膜上V1-ATPase定位障碍88-93
  • 8.1 本章引论88-89
  • 8.2 实验结果89-92
  • 8.2.1 Atg5缺失导致V-ATPase V1招募到杂交体上数量减少89-90
  • 8.2.2 降低LPOs上V-ATPase V1含量将导致LPOs再生异常90-92
  • 8.3 本章讨论与小结92-93
  • 第9章 降低细胞内pH将会修复受损的晚期胞内体/溶酶体再生过程93-96
  • 9.1 本章引论93
  • 9.2 实验结果93-95
  • 9.2.1 降低细胞内p H将修复受损的晚期胞内体 /溶酶体再生过程93-95
  • 9.3 本章讨论与小结95-96
  • 第10章 Atg5缺失造成细胞中杂交体胆固醇含量降低96-101
  • 10.1 本章引论96
  • 10.2 实验结果96-100
  • 10.2.1 Atg5缺失导致胞内杂交体胆固醇含量降低96-97
  • 10.2.2 降低WT MEF细胞中胆固醇含量影响LPOs的大小、数量和分布97-98
  • 10.2.3 降低WT MEF细胞中胆固醇含量影响V1-ATPase分布情况98-100
  • 10.3 本章讨论与小结100-101
  • 第11章 胆固醇可修复Atg5缺失细胞中V-ATPase定位和LPOs表型101-105
  • 11.1 本章引论101
  • 11.2 实验结果101-104
  • 11.2.1 增加Atg5~(-/-) MEF细胞中胆固醇含量将修复LPOs的表型101-103
  • 11.2.2 增加Atg5~(-/-) MEF细胞中胆固醇含量将修复V-ATPase的定位103-104
  • 11.3 本章讨论与小结104-105
  • 第12章 讨论与展望105-111
  • 12.1 结论105-107
  • 12.2 讨论107-111
  • 参考文献111-118
  • 致谢118-120
  • 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果120

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1 彭俊雅;Atg5蛋白调控晚期胞内体和溶酶体的生成[D];清华大学;2015年


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本文编号:450209

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