Atg5蛋白调控晚期胞内体和溶酶体的生成

发布时间：2017-06-14 18:13

  本文关键词：Atg5蛋白调控晚期胞内体和溶酶体的生成，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞自噬是真核细胞一种依赖于溶酶体的降解途径,当细胞遇到各种形式的刺激时,自吞噬将降解细胞自身大分子、细胞器和一些错误折叠的蛋白以帮助细胞缓解应激,自吞噬过程在进化上高度保守。Atg5蛋白在自吞噬过程中起重要的作用,Atg5-Atg12结合系统在自噬体膜的弯曲并招募Atg8(LC3)上起重要作用。我们的研究发现Atg5蛋白同时也在溶酶体和晚期胞内体的形成过程中扮演重要的角色,而这一过程是非自吞噬依赖途径。我们发现,在Atg5基因缺失的细胞中,出现大量的溶酶体和晚期胞内体融合形成的杂交体,这是由于从杂交体抽离晚期胞内体成分的过程受到阻碍,进而晚期胞内体成分的再循环利用过程也被阻断,导致细胞内的杂交体大量滞留,溶酶体和晚期胞内体不能进行再生。我们同时在Atg7,Atg12,Atg9基因(自噬必需基因)缺失细胞中观察晚期胞内体和溶酶体,并不能观察到与Atg5基因缺失的相同现象。晚期胞内体从杂交体抽离这一过程是受环境中的酸碱度调控,而细胞中囊泡内酸性的维持依赖于囊泡上招募的V-ATPase。我们的研究表明,V1-ATPase并不能有效被招募到酸性囊泡上,这直接导致杂交体p H升高,晚期胞内体成分不能从杂交体顺利抽离,进而导致细胞内杂交体的大量滞留。当我们在Atg5基因缺失的细胞中人为降低细胞内的p H值时,受损的溶酶体和晚期胞内体再生过程得到修复,我们看到与WT细胞中类似的晚期胞内体和溶酶体结构。我们的研究阐明了Atg5除自吞噬外的其他作用,也即Atg5在溶酶体和晚期胞内体再生过程中发挥了重要作用。
【关键词】：晚期胞内体/溶酶体再生 Atg5 自吞噬
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q26
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 英文缩略词对照表9-11
• 第1章 引言11-34
• 1.1 溶酶体、晚期胞内体生成机制概述11-29
• 1.1.1 溶酶体概述11-12
• 1.1.2 胞内体概述12
• 1.1.3 溶酶体功能12-16
• 1.1.4 溶酶体与疾病16-25
• 1.1.5 溶酶体、晚期胞内体生成机制25-29
• 1.2 Atg蛋白的研究进展29-34
• 1.2.1 Atg蛋白的分类29-33
• 1.2.2 Atg5蛋白的功能研究33-34
• 第2章 材料与方法34-51
• 2.1 试剂与抗体34-35
• 2.1.1 抗体34
• 2.1.2 试剂34-35
• 2.2 细胞培养35-36
• 2.3 细胞电转36
• 2.4 Lentivirus病毒构建以及感染36-39
• 2.5 质粒、Si RNA、Sh RNA信息39
• 2.6 活细胞成像39
• 2.7 细胞内吞囊泡提取39-40
• 2.8 免疫荧光染色40-42
• 2.9 透射电镜42
• 2.10 显微镜图像分析42
• 2.11 蛋白免疫印迹42-44
• 2.12 RNA提纯及反转录PCR44-46
• 2.13 表达质粒构建46-48
• 2.14 单克隆稳定表达细胞系构建48-49
• 2.15 胆固醇含量检测49-51
• 第3章 Atg5缺失导致晚期胞内体和溶酶体再生缺陷51-59
• 3.1 本章引论51
• 3.2 实验结果51-58
• 3.2.1 Atg5~(-/-) MEF细胞LPOs大小、数量和分布发生改变51-53
• 3.2.2 导入外源Atg5至Atg5~(-/-) MEF细胞中LPOs大小、数量和分布恢复正常53-56
• 3.2.3 Atg5敲低的大鼠肾上皮细胞（ NRK）中LPOs数量、大小和分布改变56-58
• 3.3 本章讨论与小结58-59
• 第4章 Atg5以非自吞噬依赖的方式调控晚期胞内体和溶酶体再生59-68
• 4.1 本章引论59-60
• 4.2 实验结果60-67
• 4.2.1 Atg7稳定敲低NRK细胞中晚期胞内体与溶酶体数量、大小和分布未见明显改变60-62
• 4.2.2 Atg9稳定敲低NRK细胞中晚期胞内体与溶酶体数量、大小和分布未见明显改变62-64
• 4.2.3 Atg12稳定敲低NRK细胞中晚期胞内体与溶酶体数量、大小和分布未见明显改变64-67
• 4.3 本章讨论与小结67-68
• 第5章 Atg5缺失将导致晚期胞内体和溶酶体再生停留在杂交体68-79
• 5.1 本章引论68-69
• 5.2 实验结果69-78
• 5.2.1 利用不同标记物可以显示WT MEF细胞中晚期胞内体、溶酶体和杂交体69-72
• 5.2.2 在Atg5~(-/-) MEF细胞中缺少晚期胞内体72-73
• 5.2.3 在Atg5~(-/-) MEF细胞中LPOs是晚期胞内体 -溶酶体的杂交体73-78
• 5.3 本章讨论与小结78-79
• 第6章 Atg5缺失导致晚期胞内体长管及长管调节的分裂过程受损79-84
• 6.1 本章引论79
• 6.2 实验结果79-83
• 6.2.1 Atg5缺失导致晚期胞内体长管和长管调控的分裂过程受损79-81
• 6.2.2 新生成的LPOs来源于晚期胞内体 -溶酶体的杂交体81-82
• 6.2.3 新生成的LPOs可与早期胞内体融合82-83
• 6.3 本章讨论与小结83-84
• 第7章 Atg5缺失导致晚期胞内体成分从杂交体中分离障碍84-88
• 7.1 本章引论84
• 7.2 实验结果84-87
• 7.2.1 SNX1在Atg5缺失细胞中形成增大的点状结构84-86
• 7.2.2 Atg5缺失导致由Retromer调控的晚期胞内体成分从杂交体分离过程障碍86-87
• 7.3 本章讨论与小结87-88
• 第8章 Atg5缺失导致杂交体膜上V1-ATPase定位障碍88-93
• 8.1 本章引论88-89
• 8.2 实验结果89-92
• 8.2.1 Atg5缺失导致V-ATPase V1招募到杂交体上数量减少89-90
• 8.2.2 降低LPOs上V-ATPase V1含量将导致LPOs再生异常90-92
• 8.3 本章讨论与小结92-93
• 第9章 降低细胞内pH将会修复受损的晚期胞内体/溶酶体再生过程93-96
• 9.1 本章引论93
• 9.2 实验结果93-95
• 9.2.1 降低细胞内p H将修复受损的晚期胞内体 /溶酶体再生过程93-95
• 9.3 本章讨论与小结95-96
• 第10章 Atg5缺失造成细胞中杂交体胆固醇含量降低96-101
• 10.1 本章引论96
• 10.2 实验结果96-100
• 10.2.1 Atg5缺失导致胞内杂交体胆固醇含量降低96-97
• 10.2.2 降低WT MEF细胞中胆固醇含量影响LPOs的大小、数量和分布97-98
• 10.2.3 降低WT MEF细胞中胆固醇含量影响V1-ATPase分布情况98-100
• 10.3 本章讨论与小结100-101
• 第11章 胆固醇可修复Atg5缺失细胞中V-ATPase定位和LPOs表型101-105
• 11.1 本章引论101
• 11.2 实验结果101-104
• 11.2.1 增加Atg5~(-/-) MEF细胞中胆固醇含量将修复LPOs的表型101-103
• 11.2.2 增加Atg5~(-/-) MEF细胞中胆固醇含量将修复V-ATPase的定位103-104
• 11.3 本章讨论与小结104-105
• 第12章 讨论与展望105-111
• 12.1 结论105-107
• 12.2 讨论107-111
• 参考文献111-118
• 致谢118-120
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果120

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1 彭俊雅;Atg5蛋白调控晚期胞内体和溶酶体的生成[D];清华大学;2015年

  本文关键词：Atg5蛋白调控晚期胞内体和溶酶体的生成，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：450209