SCF对造血干细胞体外扩增特性和体内生理功能的影响及机制

发布时间：2017-07-07 16:25

  本文关键词：SCF对造血干细胞体外扩增特性和体内生理功能的影响及机制

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【摘要】：来源于脐血的造血干细胞因具有干细胞含量丰富且扩增能力强、免疫原性低、采集方便和对供体无害等优势,在未来多种血液系统疾病的临床治疗中具有广阔应用前景。然而,单份脐血体积小,其中的造血干细胞数量较少,难以满足成年患者的治疗需要,严重制约了脐血造血干细胞的临床应用。为突破这一瓶颈问题,人们力求通过体外培养和扩增的方法来增加造血干细胞的数量并尽可能维持其良好的生理功能,而体外培养技术的关键在于模拟体内造血微环境。干细胞因子(stem cell factor, SCF)作为体内造血微环境中起决定性作用的关键因子,被广泛应用于造血干细胞体外培养体系,但目前其应用策略仍无统一标准,导致造血干细胞体外培养技术难于标准化、规模化,且扩增后的细胞数量及质量参差不齐。为此,本文首先考察SCF添加剂量对脐血造血干细胞体外扩增特性的影响,并通过分析体外培养过程中细胞生长与SCF消耗等动力学参数的变化,认识SCF剂量与细胞扩增数量的关系。在此基础上,通过优化SCF添加时序,期望建立一种简易有效的SCF添加策略。同时,以非肥胖糖尿病／重症联合免疫缺陷(non-obese diabete/severe combined immunodeficiency, NOD/SCID)小鼠作为动物模型,考察SCF添加策略对扩增造血干细胞体内植入和多系造血重建能力的影响,评价其体内生理功能的维持和变化。最后,采用基因芯片技术分析对应SCF添加策略扩增的造血干细胞中与SCF作用相关的信号转导途径中关键因子的基因表达差异,进一步从分子水平上阐释体外培养过程中SCF调控造血干细胞生物学特性的机制,从而为优化造血干细胞体外培养体系奠定基础。本文首先在无血清培养体系中,通过设置0、5、50和500 ng/ml四个SCF剂量,分别从总细胞扩增倍数、CD34+细胞和CD34+CD38细胞含量的维持和各系细胞组成等方面考察了SCF剂量对脐血CD34+细胞体外扩增特性的影响,结果发现SCF剂量在0～50 ng/ml范围内时,总细胞扩增倍数与SCF之间呈剂量依赖关系,增加SCF剂量可以提高总细胞扩增倍数,但超过50 ng/ml之后,再提高SCF剂量则不能继续增加总细胞数量。同时,SCF剂量的提高导致培养体系中CD34+细胞和CD34+CD38细胞含量的下降速率加快。因此,综合考虑SCF剂量对总细胞扩增及造血干细胞含量维持这两方面的影响,在本文研究条件下适宜的SCF剂量为50 ng/ml。进一步分析体外培养过程中细胞生长与SCF消耗等动力学参数,发现较高剂量的SCF可以促使细胞快速启动增殖并获得较高的比生长速率,同时还有利于延长细胞的增殖时间。此外,发现细胞比生长速率与SCF比消耗速率在培养初期(0-4 d阶段)呈正相关,表明培养初期是SCF促进造血干细胞进入增殖状态的关键时期,在此阶段只有当SCF比消耗速率大于0.15 pg/(cell×day)时,才能获得较高的细胞比生长速率,此时对应的SCF剂量为50 ng/ml。基于上述实验结果,本文进一步针对SCF添加时序设计了不同的SCF添加策略,并考察其对总细胞扩增倍数、CD34+细胞和CD34+CD38"细胞含量维持、各系细胞组成和扩增后CD34+细胞的二次扩增能力等方面的影响,发现仅在起始培养基中一次性添加SCF所获得的细胞扩增效果与在整个培养过程中定期多次添加SCF的常规培养策略相近,因此基于SCF消耗的细胞得率由(12.2±5.2)x103 cells/ng SCF大幅提高到(44.2±24.5)×103 cells/ng SCF,显著降低了造血干细胞体外培养过程的经济成本,并使培养操作更为简易。进一步以NOD/SCID小鼠为动物模型,考察和评价该SCF添加策略所扩增的CD34+细胞在小鼠体内的植入及多系造血重建能力,发现该策略扩增的CD34+细胞可以在小鼠体内成功植入并进行多系造血重建,但其植入水平和植入细胞的集落形成能力均有所下降,说明体外培养过程中适量补加SCF对维持扩增CD34+细胞的体内生理功能仍具有重要作用。为了理解和认识体外培养过程中SCF添加策略对造血干细胞生物学特性的影响及其作用机制,本文针对仅在初始培养时一次性添加SCF和定期多次添加SCF这两种策略,采用基因芯片技术检测了所扩增的CD34+细胞中由SCF介导的PI3K-AKT和JAK-STAT信号转导途径中关键分子的基因表达水平,发现了分别有68和64个基因与新鲜CD34+细胞呈差异表达,采用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件分析了这些差异表达基因与造血干细胞增殖和运动特性调控的关系。结果表明,SCF可通过PI3K-AKT和JAK-STAT这两条信号转导途径调控造血干细胞的增殖,PI3K-AKT途径中的BTK以及JAK-STAT途径中的CSF1R和IL4R对造血干细胞增殖起正调控作用；而PI3K-AKT途径中的NFKBIA以及JAK-STAT途径中的MPL和IFNG对造血干细胞增殖起负调控作用。这些差异表达基因共同作用导致细胞增殖能力被激活。由于这些基因在两种SCF添加策略所扩增的CD3矿细胞中表达水平相近,说明两种SCF添加策略刺激造血干细胞增殖的效果相似。此外,扩增的CD34+细胞在JAK-STAT信号转导途径中共有23个基因与细胞的运动特性调控相关,其中,两组中均有14个基因起正调控作用、4个基因起负调控作用,它们在两种SCF添加策略扩增的CD34+细胞中的差异表达的结果均导致细胞的迁移、趋化和归巢能力下降。在这23个基因中,TYK2、CXCL9、CCND1、GATA3和NOS25个基因在两种SCF添加策略扩增的CD34+细胞间呈差异表达,其中,TYK2、 CXCL9和CCND1对细胞迁移起正调控作用,在仅初始添加SCF策略扩增的CD34+细胞中,TYK2上调表达,而CXCL9和CCND1下调表达,IPA软件预测发现这些差异表达基因共同作用的结果导致仅初始添加SCF策略扩增的CD34+细胞的迁移和趋化能力低于定期添加SCF策略扩增的CD34+细胞。本文研究了SCF剂量和添加策略对造血干细胞体外扩增特性及体内生理功能的影响,认识了SCF介导的胞内信号转导途径中关键分子与细胞增殖和运动特性的关系,为阐释体外培养体系中SCF调控造血干细胞生物学特性的机理奠定了良好基础,对建立规模化、标准化的造血干细胞体外培养技术、推动造血干细胞的临床应用具有重要意义。
【关键词】：造血干细胞 体外扩增 干细胞因子 添加策略 生理功能 基因表达
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q813
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第1章 文献综述14-31
• 1.1 造血干细胞的生物学特性15-16
• 1.2 脐血造血干细胞的应用16-18
• 1.3 造血干细胞体外培养技术的发展18-21
• 1.3.1 基质细胞支持的造血干细胞体外培养技术18-19
• 1.3.2 多细胞因子联合应用的造血干细胞体外培养技术19-20
• 1.3.3 目前造血干细胞体外培养技术存在的问题20-21
• 1.4 造血干细胞体外扩增与造血微环境的关系21-23
• 1.4.1 造血干细胞分裂模式与造血微环境的关系21
• 1.4.2 微环境的构成以及对造血干细胞体外扩增的影响21-23
• 1.5 SCF在调控造血干细胞扩增中的重要作用23-29
• 1.5.1 SCF及其受体23-24
• 1.5.2 SCF及其受体介导的胞内信号转导途径24-27
• 1.5.3 SCF在造血干细胞体外培养中的应用27-29
• 1.6 本文主要研究内容及其目的和意义29-31
• 第2章 材料与方法31-38
• 2.1 实验材料31-32
• 2.1.1 脐血31
• 2.1.2 培养基31
• 2.1.3 细胞因子31
• 2.1.4 流式细胞仪检测用抗体31
• 2.1.5 NOD/SCID小鼠31
• 2.1.6 基因芯片31
• 2.1.7 其他试剂及材料31-32
• 2.2 实验仪器设备32
• 2.3 实验方法32-38
• 2.3.1 脐血单个核细胞的分离32
• 2.3.2 CD34~+细胞的分离32-33
• 2.3.3 细胞培养33
• 2.3.4 细胞计数33
• 2.3.5 细胞表型分析33-34
• 2.3.6 集落形成能力检测34
• 2.3.7 培养液中SCF浓度的测定34-35
• 2.3.8 CD34~+细胞的二次扩增能力分析35
• 2.3.9 CD34~+细胞在体内的植入和多系重建能力检测35-36
• 2.3.10 基因芯片分析36-37
• 2.3.11 统计学分析37-38
• 第3章 SCF添加剂量对脐血CD34~+细胞体外扩增的影响38-49
• 3.1 SCF剂量对脐血CD34~+细胞体外扩增特性的影响38-43
• 3.2 SCF剂量与细胞生长动力学之间的关系43-47
• 3.3 讨论47-48
• 3.4 本章小结48-49
• 第4章 SCF添加策略对造脐血CD34~+细胞体外扩增及生理功能的影响49-62
• 4.1 SCF添加策略对脐血CD34~+细胞体外扩增特性的影响50-52
• 4.2 SCF添加策略对扩增CD34~+细胞二次扩增能力的影响52
• 4.3 SCF添加策略对细胞得率的影响52-53
• 4.4 SCF添加策略对扩增CD34~+细胞体内植入和多系造血重建能力的影响53-60
• 4.4.1 实验设计及分组53-54
• 4.4.2 NOD/SCID小鼠存活情况54
• 4.4.3 扩增CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内的植入水平分析54-57
• 4.4.4 扩增CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内的多系造血重建能力分析57-59
• 4.4.5 NOD/SCID小鼠骨髓和脾脏细胞中的集落形成单位分析59-60
• 4.5 讨论60-61
• 4.6 本章小结61-62
• 第5章 SCF添加策略对CD34~+细胞信号转导途径相关基因表达的影响62-87
• 5.1 实验设计及数据处理方法63-66
• 5.1.1 实验设计63
• 5.1.2 芯片说明63-65
• 5.1.3 管家基因的选择65-66
• 5.1.4 数据处理方法66
• 5.2 SCF添加策略对扩增CD34~+细胞中PI3K-AKT信号转导途径中关键分子基因表达水平的影响66-72
• 5.3 SCF添加策略对扩增CD34~+细胞中JAK-STAT信号转导途径中关键分子基因表达水平的影响72-85
• 5.4 讨论85
• 5.5 本章小结85-87
• 第6章 全文总结与展望87-91
• 6.1 全文总结87-89
• 6.2 创新点89
• 6.3 建议及展望89-91
• 参考文献91-104
• 致谢104-105
• 研究成果10

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