长江口潮滩湿地氨氧化菌群动态及活性研究

发布时间：2017-07-17 09:13

  本文关键词：长江口潮滩湿地氨氧化菌群动态及活性研究

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【摘要】：近年来,人为来源活性氮的过量排放严重干扰了河口近岸生态系统的氮循环过程,由此导致了水体富营养化、有害藻类赤潮频发、近海低氧区的产生和加剧等重大而急迫的环境问题。因此,河口近岸生态系统中氮的生物地球化学循环研究引起了国内外学术界的广泛关注。氨氧化过程(包括好氧氨氧化与厌氧氨氧化)作为氮循环的重要环节,在氮素的生物地球化学循环中起着重要的作用。好氧氨氧化是以O2作为电子受体,将NH4+氧化成NO2-的过程,是硝化反应的第一步及限速步骤；而厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, anammox)是指在厌氧条件下,以NO2-作为电子受体,将NH44+氧化成N2的过程,是新近发现的重要脱氮环节。目前,在河口潮滩生态系统中有关好氧/厌氧氨氧化过程还缺乏深入系统地研究,对其微生物作用机理的认识还不甚清楚。鉴于此,论文以长江口潮滩湿地作为典型研究区,开展了河口潮滩湿地(好氧/厌氧)氨氧化菌群动态及其活性研究。论文的研究工作不仅可深化对河口潮滩氮素生物地球化学循环的理论认识,而且可为长江口湿地生态环境的管理与保护提供重要的科学依据。本论文取得的主要研究成果和认识包括：(1)运用分子生物学技术,基于氨单加氧酶基因(amoA基因),研究了长江口潮滩表层沉积物中好氧氨氧化细菌(ammonium-oxidizing bacteria, AOB)与好氧氨氧化古菌(ammonium-oxidizing archaea, AOA)的菌群结构、丰度、活性及其与环境因子之间的相关关系,并采用氨苄青霉素抑制法探讨了AOB与AOA对潜在硝化速率的相对贡献。克隆文库分析结果表明,沉积物中AOB以Nitrosomonas为优势菌,AOA以Marine group 1.1a为优势菌。AOB与AOA菌群组成及分布与盐度、pH、氨氮、总磷以及有机碳含量显著相关。AOA相对于AOB具有较高的amoA基因多样性。定量PCR表明,多数采样点AOB amoA基因拷贝数(7.36×104～5.20×106 copies g-1)大于AOA amoA基因拷贝数(5.70 × 104-6.84×105 copies g-1)。潜在硝化速率夏季(4.2～186.3 nmolNg-1h-1)显著高于冬季(2.9～30.8nmolNg-1h-1),并与盐度显著负相关。统计分析发现,潜在硝化速率与AOA的amoA基因拷贝数存在显著正相关关系,而与AOB amoA基因拷贝数不存在显著相关关系。氨苄青霉素抑制实验表明,研究区内AOA对好氧氨氧化过程的贡献率为73.4%～86.9%。(2)运用分子生物学技术与氮稳定同位素示踪技术系统揭示了长江口潮滩表层沉积物中anammox菌的菌群多样性、丰度及其活性。Anammox菌16S rRNA基因系统发育分析表明,沉积物中anammox菌群组成具有高的生物多样性,但存在明显的空间分布差异。研究发现,盐度是影响anammox菌群组成及分布的关键环境因素。沉积物中anammox菌16S rRNA基因丰度在2.63×106～1.56× 107 copies g-1范围内,其时空分布与盐度、温度及亚硝氮含量显著相关。Anammox过程的反应速率为0.94～6.61nmol Ng-1h-1,主要受温度、亚硝氮含量及anammox菌丰度控制；并且,anammox过程对河口潮滩湿地总脱氮贡献约为6.6%-12.9%。(3)潮滩自陆向海分为高潮滩、中潮滩和低潮滩,不同潮滩位置其生境存在显著差异,进而可能会影响沉积物中氨氧化速率及相关功能菌的空间分异。为此,论文探讨了好氧／厌氧氨氧化过程对不同潮滩位置环境差异的响应。研究表明,沉积物中AOB多样性从高潮滩到低潮滩逐渐升高,而AOA多样性呈现相反的变化趋势。不同潮滩位置适宜不同的AOB与AOA菌群生长。amoA基因丰度在夏季从高潮滩到低潮滩逐渐升高,而在冬季从高潮滩到低潮滩逐渐降低,这与潜在硝化速率在不同潮滩位置的变化趋势相一致。不同潮滩位置anammox菌所属菌属不同,中潮滩和高潮滩以Kuenenia为主,而低潮滩以Scalindua为主。中潮滩anammox菌多样性高于高潮滩和低潮滩。Anammox菌16S rRNA基因丰度从高潮滩到低潮滩有逐渐升高的趋势。此外,anammox速率也从高潮滩向低潮滩逐渐升高,与anammox菌丰度的变化趋势相一致。(4)由潮汐作用引起的潮滩上覆水和地下水的周期性波动,会通过控制营养盐运移,进而影响潮滩湿地厌氧氨氧化过程。为此,本论文探讨了潮汐作用对anammox过程及anammox菌群动态变化的影响机理。研究发现,anammox速率在潮滩的剖面分布表现为：沉积物表层最高(4月份：0.61nmol Ng-1h-1；10月份：0.66 nmol Ng-1h-1),之后随深度逐渐降低,在沉积物柱的中间过渡层达到最低值(4月份：0.16 nmol Ng-1h-1;10月份：0.28 nmol Ng-1h-1)。然而,在地下水控制层anammox速率又开始明显升高。Anammox菌的丰度也呈现出相似的剖面分布行为。尽管anammox菌群结构没有呈现出明显的剖面差异,但是anammox速率与anammox菌丰度的剖面分布特征反映了潮汐作用可通过控制反应基质的供给影响潮滩湿地anammox过程。营养盐的剖面分布、地下水的潮周期波动特征、以及潮汐模拟实验等也验证了这一观点。
【关键词】：氮循环 好氧氨氧化 厌氧氨氧化 功能基因 潮滩 长江口
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X172
【目录】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-17
• 图名目录17-19
• 表名目录19-20
• 第一章 绪论20-38
• 1.1 问题的提出与研究意义20-22
• 1.2 河口潮滩氮循环22-26
• 1.3 国内外研究进展26-35
• 1.3.1 好氧氨氧化过程国内外研究进展26-29
• 1.3.2 厌氧氨氧化过程国内外研究进展29-32
• 1.3.3 环境氨氧化微生物分析方法国内外研究进展32-35
• 1.4 论文研究目标与技术路线35-38
• 1.4.1 研究目标35
• 1.4.2 技术路线35-38
• 第二章 研究区域概况38-44
• 2.1 长江口自然地理特征38-40
• 2.1.1 气候和水文38-39
• 2.1.2 冲淤和地貌39
• 2.1.3 潮滩特征39-40
• 2.2 典型采样点环境特征40-44
• 第三章 长江口潮滩湿地好氧氨氧化菌群动态及其活性44-76
• 3.1 引言44-46
• 3.2 研究方法46-50
• 3.2.1 样品采集46
• 3.2.2 理化因子分析46
• 3.2.3 DNA提取与功能基因扩增46-47
• 3.2.4 测序及系统发育分析47-48
• 3.2.5 实时荧光定量PCR48-49
• 3.2.6 潜在硝化速率测定49
• 3.2.7 统计分析49-50
• 3.2.8 序列登录号50
• 3.3 研究结果50-69
• 3.3.1 采样点理化特征50-52
• 3.3.2 细菌与古菌amoA基因系统发育及多样性分析52-61
• 3.3.3 研究区AOB与AOA菌群结构的时空差异61
• 3.3.4 AOB与AOA amoA基因丰度61-65
• 3.3.5 AOB与AOA菌群结构、丰度与环境因子的相关关系65-67
• 3.3.6 潜在硝化速率67-69
• 3.4 分析与讨论69-73
• 3.5 本章小结73-76
• 第四章 长江口潮滩湿地厌氧氨氧化菌群动态及其活性76-103
• 4.1 引言76-77
• 4.2 研究方法77-83
• 4.2.1 样品采集77-78
• 4.2.2 沉积物理化性质分析78-79
• 4.2.3 沉积物总DNA提取及PCR扩增79-80
• 4.2.4 克隆、测序及系统发育分析80
• 4.2.5 实时荧光定量PCR80-81
• 4.2.6 Anammox速率与反硝化速率的测定81-82
• 4.2.7 统计分析82-83
• 4.2.8 序列登录号83
• 4.3 研究结果83-95
• 4.3.1 长江口潮滩湿地anammox菌的发现83-84
• 4.3.2 Anammox菌群组成、多样性及时空分布84-92
• 4.3.3 潮滩湿地Anammox菌丰度92-93
• 4.3.4 Anammox速率及反硝化速率93-95
• 4.4 分析与讨论95-100
• 4.5 本章小结100-103
• 第五章 氨氧化过程对不同潮滩位置环境差异的响应103-128
• 5.1 引言103-104
• 5.2 样品采集与研究方法104-107
• 5.2.1 样品采集104-105
• 5.2.2 理化因子分析105
• 5.2.3 沉积物总DNA提取、PCR、克隆、测序以及系统发育分析105-106
• 5.2.4 实时荧光定量PCR106
• 5.2.5 潜在硝化速率及anammox速率测定106
• 5.2.6 统计分析106-107
• 5.2.7 序列登录号107
• 5.3 好氧氨氧化过程对高中低潮滩环境差异的响应107-119
• 5.3.1 好氧氨氧化菌群组成对高中低潮滩环境差异的响应108-115
• 5.3.2 好氧氨氧化菌丰度对高中低潮滩环境差异的响应115-118
• 5.3.3 潜在硝化速率对高中低潮滩环境差异的响应118-119
• 5.4 厌氧氨氧化过程对高中低潮滩环境差异的响应119-126
• 5.4.1 厌氧氨氧化菌群组成对高中低潮滩环境差异的响应119-124
• 5.4.2 厌氧氨氧化菌丰度及活性对高中低潮滩环境差异的响应124-126
• 5.5 本章小结126-128
• 第六章 潮汐作用对潮滩湿地厌氧氨氧化过程的影响机理128-152
• 6.1 引言128-129
• 6.2 样品采集与研究方法129-133
• 6.2.1 样品采集129
• 6.2.2 理化因子分析129-130
• 6.2.3 潜在硝化速率测定130
• 6.2.4 Anammox速率与反硝化速率的测定130
• 6.2.5 硝酸盐异化还原成铵(DNRA)速率的测定130-131
• 6.2.6 潮汐作用模拟实验131-132
• 6.2.7 沉积物总DNA提取、PCR、克隆、测序以及系统发育分析132
• 6.2.8 末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)132
• 6.2.9 实时荧光定量PCR132-133
• 6.2.10 序列登录号133
• 6.3 潮汐作用对厌氧氨氧化过程的影响133-150
• 6.3.1 厌氧氨氧化速率的剖面分布行为135-137
• 6.3.2 厌氧氨氧化菌丰度的剖面分布行为137
• 6.3.3 厌氧氨氧化菌群结构的剖面分布行为137-138
• 6.3.4 潮汐作用对厌氧氨氧化过程影响的初步分析138-144
• 6.3.5 潮汐作用引起地下水位波动的验证144-147
• 6.3.6 潮汐影响模拟实验147-148
• 6.3.7 潮汐作用下anammox过程与相关氮循环过程的耦合148-150
• 6.4 本章小结150-152
• 第七章 结论与展望152-156
• 7.1 主要结论152-154
• 7.2 论文特色与创新154-155
• 7.3 研究展望155-156
• 参考文献156-177
• 作者简历177
• 攻读学位期间参与科研项目177-178
• 攻读学位期间科研成果178-181
• 后记181-18

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