组蛋白去甲基化酶JMJD3在SAHF形成中的作用及机制研究

发布时间：2017-09-25 09:19

  本文关键词：组蛋白去甲基化酶JMJD3在SAHF形成中的作用及机制研究

  更多相关文章： JMJD3 RB蛋白 SAHF 赖氨酸去甲基化 表观遗传修饰

【摘要】：细胞衰老是指细胞受到特定的刺激后进入不可逆的细胞周期停滞的状态。癌基因的诱导或者复制性衰老都可以引起人二倍体成纤维细胞的细胞核内染色质重排,形成异染色质凝集,这一现象被称为衰老相关的异染色质凝集(SAHF)。SAHF由细胞核内的染色体重塑凝集形成致密的染色质区域,每一条染色体形成一个凝集点,能够被DAPI染料识别出来。SAHF凝集点包含与基因沉默相关的H3K9me3、HP1蛋白、HMGA1蛋白、PML、marcoH2A等,并且将E2F靶基因也包裹在凝集点中,抑制了E2F靶基因的表达。研究表明,SAHF的形成抑制了与细胞增殖相关的基因的表达,并且一些癌细胞也能够被诱导形成SAHF,这对于开发新的抗癌药物提供了新的思路。但是目前对于SAHF组装和维持的具体过程了解的还不是很透彻。RB蛋白对于细胞生命活动至关重要,许多癌症的发生都与RB蛋白的突变有关。我们之前的研究发现在SAHF的形成过程中,RB蛋白也发挥着重要功能,一些RB蛋白突变或者不能够被激活的细胞系是不能够形成SAHF的。据报道,RB蛋白可以发生多种翻译后修饰,如乙酰化、泛素化、磷酸化、甲基化等,这些翻译后修饰可以调控RB蛋白的功能。如Ser807/811的磷酸化调控着许多细胞生命活动,并且RB蛋白的甲基化可以影响其磷酸化。但是RB蛋白究竟是怎样影响SAHF的形成的,其甲基化是否也会影响SAHF的形成过程尚不清楚。JMJD3蛋白属于JMJD家族的一个组蛋白去甲基化酶,这个家族的成员都包含有JmjC结构域。JMJD3调控了许多生命活动,比如胚胎干细胞和神经细胞的分化、巨噬细胞的炎症反应以及细胞衰老等,JMJD3的异常表达与多种癌症的发生密切相关。文献报道,在人和小鼠成纤维细胞中JMJD3能够去除p16启动子处和基因编码区的H3K27me3,激活p16基因的表达。但是在我们前期的预实验中我们发现,在p16基因缺失的细胞系MDA-MB-231中,外源过表达JMJD3依然能够诱导细胞衰老并且形成SAHF。因此我们推测在JMJD3诱导细胞衰老的过程中可能还存在一条不依赖p16的途径。在本论文的研究中我们发现,在WI38细胞中沉默JMJD3的表达会影响H-RasV12诱导的细胞衰老以及SAHF形成,JMJD3的表达对SAHF的形成是必需的。JMJD3在H-RasV12诱导的细胞衰老以及SAHF形成过程中表达上调,在WI38细胞中过表达JMJD3可以诱导细胞形成SAHF,并且这一过程是需要其去甲基化酶活性的。免疫荧光实验分析发现在SAHF形成过程中,JMJD3在细胞质中的表达明显上升,但是在细胞核中并没有明显的升高,蛋白质免疫共沉淀实验证实JMJD3能够与RB蛋白相互作用,进一步研究发现JMJD3通过其JmjC结构域与RB蛋白的659-840结构域相互结合。体外甲基化-去甲基化实验发现JMJD3能够催化Set7/9介导的RB蛋白的甲基化位点去甲基化,并且确定了去甲基化的位点是RB蛋白第810位赖氨酸,表明组蛋白去甲基化酶JMJD3也可以催化非组蛋白去甲基化。随后我们检测出JMJD3的过表达以及干涉会影响RB蛋白与CDK4的结合情况,实验结果表明JMJD3催化RB去甲基化的作用抑制了CDK4与RB蛋白的结合,降低了RB蛋白S807/811的磷酸化水平,进而抑制了E2F靶基因的表达,促进细胞衰老形成SAHF。本论文的研究结果表明,JMJD3是一个新的SAHF的诱导因子,JMJD3可以通过催化非组蛋白RB蛋白K810位去甲基化,促进SAHF的形成。发现非组蛋白的翻译后修饰参与细胞衰老和SAHF形成,为更好的了解SAHF形成的机制提供了重要的实验依据。
【关键词】：JMJD3 RB蛋白 SAHF 赖氨酸去甲基化 表观遗传修饰
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q343
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-11
• 第一部分 引言11-29
• 一、细胞衰老11-22
• （一）细胞衰老的特点及意义11-13
• （二）细胞衰老相关的异染色质凝集13-16
• 1. SAHF简介13-14
• 2. SAHF的形成过程14-16
• 3. SAHF形成中的表观遗传修饰16
• （三）与SAHF形成相关的信号通路16-18
• （四）细胞衰老的原因18-21
• （五）SAHF的形成与癌症21-22
• 二、组蛋白去甲基化酶JMJD322-24
• （一）组蛋白去甲基化酶家族简介22-23
• （二）组蛋白去甲基化酶JMJD3的功能简介23-24
• 三、RB蛋白及其翻译后修饰的功能及影响24-27
• （一）蛋白的翻译后修饰24
• （二）RB蛋白介绍24-27
• 四、本论文研究的内容及意义27-29
• （一）立题依据27
• （二）研究的内容及意义27-29
• 第二部分 实验材料及方法29-52
• 一、实验材料29-31
• （一）蛋白质与抗体29-30
• （二）哺乳动物细胞系30
• （三）试剂30-31
• 二、实验方法31-52
• Ⅰ.分子生物学实验方法31-41
• （一）质粒构建31
• （二）DNA琼脂糖凝胶电泳31
• （三）质粒大量制备方法31-32
• （四）哺乳动物细胞总RNA的提取方法及反转录PCR32-33
• （五）PCR及荧光实时定量PCR33-36
• （六）慢病毒干涉质粒构建36-37
• （七）Flag亲和层析37
• （八）GST融合蛋白纯化及GST Pull-down实验37-39
• （九）体外甲基化-去甲基化实验39-41
• Ⅱ.细胞生物学实验方法41-50
• （一）哺乳动物细胞系的培养41
• （二）PEI转染41
• （三）逆病毒包装及感染41-42
• （四）慢病毒包装及感染42-43
• （五）Western Blotting检测43-45
• （六）DAPI染色实验45-46
• （七）免疫荧光检测46-47
• （八）衰老染色47
• （九）BrdU掺入47-48
• （十）细胞质/细胞核蛋白质抽提48-49
• （十一）蛋白质免疫共沉淀49-50
• Ⅲ.统计分析50-52
• 第三部分 实验结果与分析52-72
• 一、干涉JMJD3表达抑制SAHF的形成52-54
• （一）JMJD3在H-RasV12诱导WI38细胞形成SAHF过程中表达上调52
• （二）干涉JMJD3逆转H-RasV12诱导WI38细胞衰老52-53
• （三）沉默JMJD3后H-RasV12诱导WI38细胞形成SAHF比率下降53-54
• 二、过表达JMJD3诱导SAHF形成54-57
• （一）外源过表达JMJD3诱导WI38细胞衰老54-55
• （二）外源过表达JMJD3诱导WI38细胞形成SAHF55-57
• 三、JMJD3与RB蛋白相互作用57-62
• （一）JMJD3在SAHF形成过程中在细胞质中聚集57-58
• （二）JMJD3与RB蛋白相互结合58-59
• （三）JMJD3通过其JmjC结构域与RB蛋白相互作用59-62
• 1. RB蛋白能结合到JMJD3蛋白的JmjC结构域59-60
• 2. RB蛋白的 659-840结构域与Jmj C直接结合60-62
• 四、JMJD3能够对RB蛋白K810位去甲基化62-67
• （一）JMJD3能够催化RB蛋白去甲基化62
• （二）JMJD3能够催化Set7/9 介导的RB蛋白甲基化位点去甲基化62-65
• （三）JMJD3催化RB去甲基化的位点是第810位65-67
• 五、JMJD3催化RB去甲基化从而抑制RB蛋白的磷酸化67-72
• （一）JMJD3抑制RB蛋白的磷酸化67-69
• （二）JMJD3抑制RB与CDK4的结合69
• （三）RB的去甲基化抑制E2F靶基因的表达，进而促进SAHF的形成69-72
• 第四部分 讨论72-77
• 一、SAHF形成中的表观遗传修饰72-74
• 二、JMJD3诱导细胞形成SAHF不依赖于p16途径74-75
• 三、RB蛋白甲基化-去甲基化修饰与磷酸化修饰之间的crosstalk75
• 四、RB蛋白的去甲基化影响部分E2F靶基因的表达75-76
• 五、JMJD3诱导SAHF形成的机制76-77
• 主要结论和创新点77-78
• 一、主要结论77
• 二、主要创新点77-78
• 参考文献78-93
• 附录93-96
• 致谢96-97
• 在校期间公开发表论文情况97

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