自噬相关基因遗传变异与非小细胞肺癌预后的关联及功能研究

发布时间：2017-12-08 13:25

  本文关键词：自噬相关基因遗传变异与非小细胞肺癌预后的关联及功能研究

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【摘要】：背景:世界范围内,肺癌是最为常见的一种恶性肿瘤,据估计,仅2012年,全球共有180万例肺癌新发病例,占所有肿瘤的13%,我国肺癌发病率和死亡率呈上升趋势,且一直高于世界平均水平。因此,肺癌严重威胁我国居民生命健康,是亟待解决的公共卫生问题。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)在所有肺癌病例中的比例超过85%。早期NSCLC的主要治疗手段是手术治疗,但由于其复发和转移率高,NSCLC患者的5年生存率仍低于20%。目前已知的肺癌预后影响因素包括临床分期、组织学类型、吸烟情况等,但即使临床分期或其他宏观因素相同的患者其预后也存在较大差异。因此,发现和应用特定生物标志物,评估这些分子事件或者中间标志物在肺癌患者预后中的作用,结合传统的临床分期,将有助于更好的指导临床治疗和随访监测。自噬(autophagy)是非原核生物中一种进化高度保守的自我消耗过程。其本质上是细胞内的一种应激反应机制,使细胞内的蛋白质和损伤细胞器在溶酶体的作用下重新被细胞捕获利用。自噬是自噬体结构演变的动态过程,主要包括自噬体的形成、自噬体的延长、成熟、自噬体与溶酶体融合并酶解物质这4个部分,整个过程是由一系列自噬相关基因(autophagy-relatedgenes,ATGs)调控的。自噬体的形成依赖两条经典的泛素化-蛋白系统:ATG12与微管相关蛋白 1 轻链 3(the microtubule-associated protein llight chain 3,LC3)系统。目前已发现了 34种自噬相关基因,主要包括ATG3,ATG5,ATG7,ATG10,ATG12等。众多研究证实自噬相关基因(ATGs)在肿瘤的发病机理、临床治疗以及预后方面发挥着重要的生物学作用。然而,目前尚未有研究阐明上述自噬相关基因与非小细胞肺癌预后的关联及调控机制。单核苷酸多态性(SNP)可通过直接或间接调控基因的表达水平,从而影响疾病的发生发展。其中,表达数量性状定位分析(Expression Quantitative Trait Loci,eQTL)是一种采用DNA微阵列技术分析群体中个体的基因表达谱,将基因表达水平作为数量性状采用QTL分析定位控制该基因的表达QTL的一种分析方法,主要用于阐述潜在功能性遗传变异位点对基因表达水平影响。特定位点的DNA甲基化水平的遗传变异,也被称之为甲基化表达数量性状基因座(methylation quantitative trait loci,meQTL)。meQTL 分析方法与 eQTL 分析类似,是将基因表达水平作为数量性状,探讨DNA甲基化水平与基因表达之间关系的分析方法。因此,eQTL和meQTL分析方法综合考虑SNP、DNA甲基化水平和基因表达的相关性,在遗传学和表观遗传学方面建立了良好的功能学联系,可阐述疾病相关遗传变异的作用方式。目的:探讨自噬通路相关基因遗传变异与中国人群非小细胞肺癌预后的关联及功能。方法:本研究选择了自2003年6月以来在江苏省人民医院和江苏省肿瘤医院收集的1341例非小细胞肺癌病例,所有病例均经病理组织学和细胞学明确诊断。所有的病例自收集之日起,按预先设计好的随访周期和方式(电话随访患者本人或其家属)进行定期随访,主要的随访内容包括患者后续治疗情况、转移与复发、死亡信息等。生存时间定义为确诊日期至死亡日期或者最近一次随访日期(2013年8月)。截至2013年8月,共有1001例病例成功完成随访,随访成功率为74.6%,中位生存期(median survival time,MST)为26个月。候选基因包括参与自噬体形成的ATG3,ATG5,ATG7,ATG10,ATG12这5个重要的自噬相关基因(ATGs)。运用HapMap SNP数据库(phase II+III Feb 09,onNCBIB36assembly,dbSNPbl26)以及 HaploView 4.2 软件进行选点,并运用SNPinfo网站(http://snpinfo.niehs.nih.gov/)进行功能学预测。最终,共有 14 个 SNPs 纳入本研究。采用 Illumina Infinium(?)Human Exome BeadChip 芯片进行基因分型。生物信息学及统计分析方法主要包括运用GTEx肺组织和TCGA数据库中肺腺癌样本信息,运用eQTL和meQTL分析方法进行位点与mRNA表达水平、甲基化位点之间的关联分析,用Spearman等级相关分析基因型、甲基化以及基因表达之间的关系。生存曲线采用Kaplan-Meier方法绘制、运用Log-rank检验生存时间之间的差异,单因素和多因素Cox回归计算风险比例,t检验进行细胞增殖和迁移数据分析。功能学实验包括采用RTCA和CCK8细胞增殖实验检测肺癌细胞的增殖情况、RTCA和Transwell小室实验检测肺癌细胞的迁移情况、Real-Time PCR检测基因的表达情况。结果:ATG1O rs1864183的不同基因型携带者的生存时间存在差异(相加模型和显性模型下Log-rankP0.05)。多因素Cox回归模型表明,在调整了年龄、性别、吸烟情况、手术治疗、临床分期、放疗、化疗以及组织学类型后,ATG10 rs 10514231、rs1864182及rs1864183与非小细胞肺癌患者的死亡风险存在显著关联。eQTL分析结果显示,ATG1O上3个候选SNPs的突变型等位基因(rs10514231 G,rs1864182 C 和 rs1864183 G)与ATG 的 mRNA 表达水平升高显著相关(P值分别为8x10-12,7×10-11和0.02)。Cox回归模型表明,在校正了年龄、性别和临床分期之后,ATG10mRNA表达升高显著增加非小细胞肺癌患者的死亡风险(校正 HR = 2.10,95%CI= 1.33-3.29,P=0.001)。meQTL分析结果显示,在校正了年龄、性别和临床分期之后,ATG10上CpG位点cg17942617的高甲基化会增加肺癌患者死亡风险(校正HR= 1.77,95%CI =1.06-2.97,P = 0.029)。同时,ATG10 rs10514231 和 rs1864182 突变型等位基因对应的CpG位点cg17942617的甲基化水平更高(P值分别为0.006和0.017)。线性回归模型结果表明,随着cg17942617甲基化水平的增加,ATG10 mRNA表达水平也显著增加,非小细胞肺癌患者的生存时间显著缩短(rho = 0.129,P=0.008)。细胞学实验证实,过表达ATG10可导致肺癌细胞A549和H1299增殖和迁移能力增强;siRNA下调ATG10表达可导致肺癌细胞A549和H1299增殖和迁移能力减弱。结论:本课题首次探讨了自噬相关基因遗传变异与中国人群非小细胞肺癌预后间的关联及生物学功能,为指导临床预后评估提供了新的分子标志物,也有助于揭示非小细胞肺癌发生发展的分子机制。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】

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本文编号：1266546