阿奇霉素注射液潜在致心律失常风险的机制研究

发布时间：2017-12-25 00:15

本文关键词：阿奇霉素注射液潜在致心律失常风险的机制研究　出处：《南京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:阿奇霉素是临床常用的大环内酯类抗菌药,不良反应相对较少。但近几年,有越来越多的证据表明阿奇霉素可能增加心血管死亡风险,尤其是心律失常的发生。纵观大量文献报道,未见有对其在动物水平上的致心律失常的机制研究。为了验证这一风险存在的真实性,降低临床用药的不良反应发生率,所以我们对此药进行了一系列基础的心脏安全性评价实验。药物与试剂马来酸阿奇霉素注射液(津博),规格0.25 g,从南京市仙林鼓楼医院购买,生产批号081406026,国药准字H20020293,生产厂家:天津生物化学制药有限公司。其他化学试剂大部分购自Sigma公司,小部分购自国产代理商。动物豚鼠,质量250～350g,雄性,由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。实验动物生产许可证:SCXK(沪)2013-0006。方法:1.豚鼠在体心电图记录:20%乌拉坦(5 mL/kg)对豚鼠进行腹腔麻醉,以仰卧位进行固定,分出一侧颈静脉,进行插管,再给药。四肢皮下扎入针形电极引导记录Ⅱ导联心电信号,经四道生理记录仪采样并存入计算机。于静脉推注药物5 min后记录心电图,分析心率(HR)、P-R间期、QRS间期和QTc间期。按照阿奇霉素注射液说明书规定的:成人用量为每人每天500 mg(静脉滴注),在体实验采用500 mg为1倍临床剂量,即8.3 mg/kg.(按成人60 kg计算)。人体与动物用药量按体表面积系数计算,以每公斤体重进行比较。国际标准:豚鼠的剂量为人用剂量的4.6倍,基于这种换算原则,豚鼠在体一倍剂量为38.2 mg/kg,依次类推。2.豚鼠离体心电图记录:20%乌拉坦(5 mL/kg)对豚鼠腹腔注射麻醉,固定后迅速开胸取出心脏,置于0℃C的无钙灌流液中。应用改进的Langendorff装置灌流系统,经主动脉进行离体心脏灌流,心脏复跳后在心外膜下置3根银丝电极:正极置于心尖处,负极置于右心房,接地电极置于主动脉根部,引导出离体心脏心电图。待豚鼠心脏跳动稳定后,信号经四道生理记录仪输入计算机记录,分析心率(HR)、P-R间期、QRS间期和QTc间期。按照阿奇霉素注射液说明书规定的:成人用量为每人每天500 mg(静脉滴注),即8.3 mg/kg(按成人60 kg计算)。成人细胞外液约占体重的20%,那么换算成临床血药浓度即为41.5 mg/L,据上述方法换算后,离体实验的组织和细胞灌流液1倍临床浓度为41.5 mg/L。豚鼠的离体心脏心电图实验按照1,5,10倍的临床浓度给药,每一浓度的灌流液体积为20 mL,灌流速度约2～3 mL/min。3.豚鼠左心室乳头肌动作电位记录:用20%乌拉坦(5mL/kg)对豚鼠进行腹腔麻醉,快速开胸取出心脏,置于0～4℃无钙台氏液中停止搏动,剪下左心室乳头肌,将其固定于恒温(35.5～36.5℃水浴槽底部。恒温恒速条件下用含钙台氏液灌流,稳定30 min后进行实验。刺激频率1Hz,波宽10 ms,强度1.5倍阈值的方波刺激。信号经放大器、数模转换器显示于电脑屏幕并记录在计算机内部,分析动作电位复极50%(APD50)及90%(APD90)水平的时程。4.豚鼠左心室单个肌细胞动作电位记录:用改良后的酶解法分离豚鼠单个心室肌细胞。健康豚鼠,雄性,250～300g。腹腔注射20%乌拉坦(5mL/kg),在100%氧饱和的0℃无钙台氏液中清洗修剪,并将其固定在改良的Langendorff心脏灌流装置上,在37℃的恒温,充氧(95%O_2+5%CO_2)条件下,用无钙灌流液持续逆向灌流,使心脏先复跳后停跳,再用含消化酶(Collage-naseⅡ2 mg/mL,胰蛋白酶0.1mg/mL)的无钙灌流液反复灌流40min,至心脏膨大、松弛,最后再用适量KB液灌流冲洗。取下心脏,将消化后的左心室肌组织块置于盛有KB液的玻璃皿中充分剪碎,用直径200 μm的尼龙网过滤,将细胞悬液导入离心管中,静置,KB液洗三次。最后置于室温下备用。无钙灌流液的组成(mM):NaCl 135,KC1 5.4,NaH_2PO_4 0.33,MgCl_2 1,HEPES 5,Glucose 10,pH 用 NaOH 调至 7.4。KB 液组成(mM):KC1 25,NaH_2PO_4 10,L-谷氨酸 70,Taurine 10,EGTA 0.5,HEPES 20,Glucose 11,KOH 85,pH 用 KOH 调至 7.4。采用膜片钳全细胞电流钳记录方法,在室温(22～25℃)下进行。将细胞悬液数滴加入倒置显微镜上的灌流槽中,待细胞稳定后,用细胞外液灌流。其组成为(mM):NaCl 117,KC15.7,NaHCO_3 4.4,MgCl_2 1.7,HEPES 20,Glucose 20,Taurine 20,CaCl_2 1.8,用 NaOH 调节 pH至7.3。选取杆状,横纹清晰,表面无颗粒,无收缩的细胞进行封接实验。玻璃毛细管经微电极拉制仪两步拉制成尖端直径约为1μm的电极,电极充灌内液后入水阻抗约2～5 MΩ,电极内液组成(mM):KCl 135,EGTA 10,Glucose 5,HEPES 10,Na2-ATP 3,Na-GTP 0.5,pH用KOH调至7.1。调节三维操纵器使电极尖端移向细胞表面进行封接。在电压钳模式下测电阻,当封接电阻达到1GΩ以上后补充快电容,并给予负压破膜形成全细胞记录模式。在电流钳模式下记录动作电位,电信号由膜片钳放大器放大,再经数模转换器转换与计算机对接,在电脑屏幕上显示出电变化,信号的发放、采集与数据分析均由Clampfit 10.4(Axon Instruments,USA)软件完成,并将数据存储于电脑硬盘,分析动作电位复极50%(APD50)及90%(APD90)水平的时程。5.全细胞电压钳记录L型钙电流:采用膜片钳全细胞电压钳记录方法,在室温(22～25℃)下进行。将细胞悬液数滴加入倒置荧光显微镜上的灌流槽中,细胞稳定后,用细胞外液灌流。L 型钙电流(Ica-L)记录细胞外液组成(mM):NaCl 132,CsCl 5.4,CaCl_2 1.8,MgCl_2 1.8,NaH_2PO_4 0.6,4-AP 5,HEPES 10,Glucose 10,Na-pyruvate 5,pH 用 NaOH 调至 7.4。电极内液组成(mM):CsCl 130,MgCl_2 2,EGTA 11,HEPES 20,Glucose 10,Na_2-ATP 2,Na-GTP 0.1,pH 用 NaOH 调至 7.4。刺激程序:钳制电压为-80 mV,阶跃到-40 mV并维持200 ms(使Na~+电流失活),然后施加到0 mV的300 ms试验电压。6.全细胞电压钳记录Na+电流:采用膜片钳全细胞电压钳记录方法,在室温(22～25℃C)下进行。将细胞悬液数滴加入倒置荧光显微镜的灌流槽中,细胞稳定后,用细胞外液灌流。钠电流(INa)记录细胞外液组成(mM):NaCl 70,Choline-Cl 70,KCl 5.4,MgCl_2 1,CaCl_2 0.1,HEPES 10,Glucose 10,NaH_2PO_4 0.33。用 NaOH将pH 值调至 7.3。电极内液组成(mM):CsCl 120,EGTA 11,HEPES 10,Na_2-ATP 5,MgCl_2 5,CaCl_2 1,Glucose 11。pH 用 CsOH 调至7.3。刺激程序:在电压钳状态下,以10 mV的阶跃使心室肌细胞由-90 mV的保持电压逐步去极化至+60 mV,刺激电压持续60 ms。7.全细胞电压钳记录快速延迟整流钾电流(Ikr):采用膜片钳全细胞电压钳记录方法,在室温(22～25℃)下进行。将细胞悬液数滴加入倒置荧光显微镜上的灌流槽中,细胞稳定后,用细胞外液灌流。快速延迟整流钾电流(IKr)记录细胞外液组成(mM):NaCl 140,KC1 5.4,MgCl_2 1,CaCl_2 1.5,Glucose 10,HEPES 10,pH 用 NaOH 调至 7.4。电极内液组成(mM):KC1 140,MgCl_2 1,Na_2-ATP 4,EGTA5,HEPES 10,pH用KOH调至7.3。此外细胞外液中还需加入200μmol/L的 4-AP 阻断 Ito,20μmol/L 的 Chromanol 293B 阻断 Iks,200μmol/L 的 BaCl_2 阻断 Ik1,10μmol/L的硝苯地平阻断Ica-L。刺激程序:采用常规全细胞膜片钳记录,实验在室温(22～25 ℃C)下进行,心室肌细胞钳制在-40 mV,从-40 mV开始以阶跃电压10 mV的方式逐步去极化至60 mV,维持3000 ms,然后电压复极至-40 mV,2000 ms诱发Ikr外向尾电流。结果:1.阿奇霉素注射液对豚鼠在体心脏心电图的影响:结果显示:阿奇霉素注射液1,3,5倍临床剂量,既38.2 mg/kg→114.6 mg/kg→191 mg/kg按顺序累计静脉推注,AZM38.2mg/kg略微改变豚鼠在体心电图各参数,未有显著性差异;AZM114.6mg/kg明显改变豚鼠在体心电图各参数,并且AZM114.6mg/kg药物组与对照组和AZM 38.2 mg/kg药物组相比,具有显著性差异。AZM 114.6 mg/kg能够显著降低心率,延长P-R间期和QTc间期,增大QRS波宽,降低QRS波和P波幅度;AZM 191 mg/kg,显著降低心率,QRS波宽大变形,P波、T波消失。2.阿奇霉素注射液对豚鼠离体心脏心电图的影响:结果显示:阿奇霉素注射液1,5,10倍临床浓度,按照41.5 mg/L → 207.5 mg/L→ 415 mg/L→Wash out的顺序依次灌流,AZM 41.5 mg/L明显降低心率,与对照组相比有显著性差异;AZM207.5mg/L和AZM415mg/L明显降低心率,延长P-R和QTc间期,增大QRS波宽,其中HR、P-R、QRS三指标变化与对照组及低剂量组形成显著性差异,QTc只与对照组形成显著性差异;含钙灌流液洗脱后,各指标部分恢复。3.阿奇霉素注射液对豚鼠左心室乳头肌动作电位的影响:不同浓度的AZM能够不同程度的延长单个心肌细胞的动作电位时程(APD),且有一定的浓度依赖性;各浓度药物组与对照组的APD50和APD90相比较,AZM830mg/L(20倍临床浓度)组与对照组和AZM 41.5 mg/L(1倍临床浓度)组有显著性差异,而AZM 415 mg/L(10倍临床浓度)组与对照组也形成显著性差异。4.阿奇霉素注射液对豚鼠单个心室肌细胞动作电位的影响:不同浓度的AZM能够不同程度的延长单个心肌细胞的动作电位时程(APD),且有一定的浓度依赖性;各浓度药物组与对照组的APD50和APD90相比较,只有AZM830 mg/L(20倍临床浓度)组与对照组和AZM 41.5 mg/L(1倍临床浓度)组有显著性差异。5.阿奇霉素注射液对豚鼠左心室肌细胞L型钙电流的影响:各浓度阿奇霉素都能明显抑制L-型钙通道,与低浓度组相比,各高浓度组对ICa-L的平均抑制率都具有显著性差异(P0.05),AZM 1245 mg/L(30倍临床浓度)组和AZM 2075 mg/L(50倍临床浓度)组的抑制率都大于50%,故AZM抑制L型钙电流的IC500小于1245 mg/L,为942.5±68.4 mg/L。6.阿奇霉素注射液对Na~+电流的影响:各浓度阿奇霉素都能明显抑制钠通道,与低浓度组相比,各高浓度组对INa的平均抑制率都具有显著性差异(P0.05),AZM 1245 mg/L(30倍临床浓度)和AZM 2075 mg/L(50倍临床浓度)抑制率都大于50%,故AZM的对Na+电流的IC50小于1245mg/L,为1123.0±87.9 mg/L。7.阿奇霉素注射液对Ikr的影响:阿奇霉素不同浓度对正常豚鼠单个心室肌细胞的快速性延迟整流钾电流(IKr)都有一定的抑制作用,且存在浓度依赖性,AZM为最大实验浓度2075 mg/L(50倍临床浓度)时,对Ikr的抑制率仅为31%左右,故AZM抑制Ikr的IC50大于50倍临床浓度。结论:1.通过豚鼠在体ECG和离体ECG实验,能够初步证明阿奇霉素注射液的确能够造成心动过缓,稳定诱发缓慢型心律失常。2.组织块和单细胞动作电位实验表明,AZM明显延长APD50和APD90,使心脏复极延迟,进一步验证了 AZM的致心律失常作用。3.离子通道实验,阿奇霉素能够不同程度阻滞L型钙通道、钠通道、快速延迟整流钾电流通道,但AZM对ICa-L、INa抑制程度远大于IKr,AZM浓度由低到高的过程,抑制ICa-L、INa先于Ikr,这与心电图实验结果相吻合。揭示AZM能诱导正常豚鼠发生房室传导阻滞和心室内传导阻滞,这可能与其明显抑制钠、钙通道有关。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

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