基于细胞生物色谱法的苦碟子注射液保护缺氧损伤内皮细胞的效应成分研究

发布时间：2018-01-08 13:20

本文关键词：基于细胞生物色谱法的苦碟子注射液保护缺氧损伤内皮细胞的效应成分研究　出处：《北京中医药大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目前,作为社会多发性疾病之一的心脑血管疾病已严重影响到了人类的生活质量。苦碟子注射液在治疗该类疾病方面具有较好的疗效,已广泛应用于临床。但是,苦碟子注射液的药效物质基础尚不明确,制约了其临床安全用药研究。传统中药物质基础的研究通常会耗费大量的时间在非有效成分或无效成分的分离提取与结构鉴定上,在分离提取过程中也会导致活性成分或有效成分的丢失。针对上述问题,相关研究者引入了以活性为导向的中药化学成分研究方法。本课题首次应用细胞生物色谱法对临床常用中药苦碟子注射液治疗脑缺血性疾病的药效成分进行研究:选择人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为靶细胞,使苦碟子注射液中的活性成分与靶细胞特异性结合,经细胞靶点脱敏失活后,再从细胞中释放出被结合的活性成分,并应用LC-MS快速鉴定靶向亲和的化学成分,得到候选的活性成分;最后结合体外药效学实验以及相关文献查阅以对其活性进行验证。本研究可快速有效地筛选苦碟子注射液治疗脑缺血性疾病的药效成分。同时,通过建立HUVEC体外培养体系及模拟脑血管内皮细胞缺氧损伤模型,可为体外脑缺血性疾病药效物质基础研究提供一种快捷、有效的方法学借鉴。目的应用UHPLC-HR-MSn技术分析检测苦碟子注射液中原型成分及其在大鼠血浆中的移行成分;应用细胞生物色谱法及UHPLC-LTQ-Orbitrap质谱联用技术快速筛选鉴定苦碟子注射液中治疗脑缺血性疾病的候选活性成分;通过体外实验,对苦碟子注射液治疗脑缺血性疾病的候选活性成分进行药效学研究。方法1.尾静脉注射苦碟子注射液后,收集给药前后的大鼠血浆,经固相萃取法处理后,采用色谱柱 ACQUITYUPLCBEHC18(1.7μm,2.1×100mm)和 0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)流动相系统进行梯度洗脱;应用LTQ-Orbitrap质谱仪在负离子模式检测苦碟子注射液中的化学成分以及血浆样品中的原型成分和代谢产物。2.选择HUVECs作为靶细胞,先使苦碟子注射液中的活性成分与靶细胞特异性结合,经细胞靶点脱敏失活后,应用LC-MS快速鉴定与细胞靶向亲和的化学成分,从而筛选得到苦碟子注射液治疗脑缺血性疾病的候选活性成分。3.建立Na2S2O4诱导的HUVECs缺氧损伤模型,并给予不同浓度NaHS及候选活性成分进行干预。经CCK-8试剂盒(CCK-8)检测不同浓度药物干预后的细胞活力,从而确定候选活性成分的给药浓度以及初步判断其药效作用。检测HUVECs在缺氧损伤后细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)漏出率及通过文献查阅对候选活性成分的药效作用进行探讨。结果1.根据精确分子量数据和多级质谱碎片,结合对照品比对,从苦碟子注射液中分析鉴定了 53个成分,包括18个有机酸、15个黄酮、18个倍半萜内酯、2个核苷;从大鼠血浆中分析检测到38个原型及代谢产物,其主要代谢途径为甲基化、羟基化、水解、葡萄糖酸酸化及它们的复合反应等。2.根据获得的精确分子量数据、保留时间以及结合苦碟子注射液中的成分进行鉴定归属,从细胞裂解液中共筛选鉴定出9个化学成分,其中包括有机酸类成分3个、黄酮类成分2个及倍半萜内酯类成分4个;其中,与细胞靶向亲和的化学成分均包含在入血成分内。3.在一定浓度范围内,NaHS、绿原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及11,13α-dihydroixerin Z可以使缺氧HUVECs的细胞活力明显增强、SOD活性明显升高而LDH漏出率明显降低(P0.01或P0.05)。对于另外6个未进行活性验证的单体化合物则通过相关文献查阅,表明大多数候选活性成分的确具有一定的药理活性。结论1.应用UHPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液质联用技术较为全面地阐明了苦碟子注射液化学成分及其在大鼠血浆中的移行成分,可为下一步苦碟子注射液与靶细胞结合成分的鉴定提供基础。通过对苦碟子注射液入血成分进行分析鉴定,可为苦碟子注射液药理、药效研究以及药效物质基础研究提供科学依据。2.应用细胞生物色谱法与UHPLC-LTQ-Orbitrap质谱联用技术快速筛选鉴定苦碟子注射液治疗脑缺血性疾病的候选药效成分,为体外脑缺血性疾病药效物质基础研究提供一种快捷、有效的方法学借鉴。3.通过建立HUVECs体外培养体系及模拟血管内皮细胞缺氧损伤模型,可为脑缺血性疾病体外研究提供一种简便、可靠的方法。通过体内动物实验、体外药效学实验以及对候选活性成分的药理活性进行文献查阅,进一步验证了细胞生物色谱法筛选中药中活性成分的方法是有效的,为研究苦碟子注射液药效物质基础提供了科学依据。同时,为复杂体系中药的药效物基础研究提供了思路。
[Abstract]:A rapid and effective method for the treatment of cerebral ischemia diseases is studied by means of HPLC and UHPLC - LTQ - Orbitrap mass spectrometry . A simple and reliable method for the determination of the active components in the rat plasma by HPLC and UHPLC - LTQ - Orbitrap mass spectrometry is provided .

【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R286.0

【参考文献】