齐墩果酸衍生物SZC015诱导非小细胞肺癌凋亡及自噬的作用机制研究

发布时间：2018-03-18 18:29

  本文选题：齐墩果酸衍生物　切入点：SZC015　出处：《大连医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的:齐墩果酸(Oleanolic Acid,OA)是一种五环三萜类化合物,广泛存在于多种类型的天然植物中。但其药理活性相对较弱,生物利用度较低,限制了其进一步研究与应用。本研究中,我们从OA衍生物SZC009,SZC014和SZC015中筛选出最佳抗肿瘤活性衍生物SZC015,并对其体外抗非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)作用及其潜在的分子机制进行了探究。方法:(1)MTT法检测不同浓度OA及其衍生物SZC009、SZC014、SZC015对人NSCLC系A549、H1299和H322以及人正常支气管上皮细胞HBE的生存率影响;(2)分别使用光学显微镜和电子透射显微镜观察SZC015诱导H322细胞发生凋亡和自噬的形态学变化;(3)倒置荧光显微镜观察细胞凋亡的形态变化;(4)流式AV-PI双染法检测SZC015对H322细胞凋亡百分率的影响;(5)流式PI染色法检测SZC015对H322细胞周期阻滞的影响;(6)流式DCFH-DA荧光染色法检测SZC015处理后H322细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的变化;(7)Western blotting法测定细胞内Procaspase3、Procaspase9、Bcl-2、Bax、LC3B、Akt、p-Akt、p-IκBα、P65与p-P65蛋白的表达水平;(8)免疫荧光染色法探究SZC015作用下的H322细胞内P65蛋白的核转位现象。结果:(1)与空白对照组相比,SZC015能够显著性抑制人NSCLC A549、H1299和H322细胞增殖活性,并呈现时间剂量依赖性,而对正常的人支气管上皮细胞HBE的抑制增殖作用较弱,表明SZC015对NSCLC的细胞增殖具有选择性抑制作用。(2)与空白对照组相比,SZC015能够明显改变细胞形态,细胞凋亡数目明显增多,且呈剂量依赖性,表明SZC015能够诱导H322细胞凋亡。(3)与空白对照组相比,SZC015处理H322细胞后可明显提高凋亡细胞百分比和Bax/Bcl-2的蛋白比值,降低Procaspase-3、Procaspase-9蛋白表达,表明SZC015能诱导H322细胞发生凋亡。经OA处理后的H322细胞Procaspase-3蛋白表达高于SZC015,凋亡现象越明显,Procaspase-3蛋白表达的程度越低,进一步表明SZC015对H322细胞的促凋亡作用可能优于OA。(4)与空白对照组相比,SZC015处理H322细胞后,通过电子透射显微镜可观察到H322细胞胞浆中明显呈现出自噬小体,并且LC3B-I向LC3B-II转变增多,且呈剂量依赖性,表明SZC015能诱导H322细胞自噬。与OA相比,SZC015诱导H322细胞内LC3B-II/I蛋白表达上升,自噬现象越明显,LC3B-I向LC3B-II的转变越多,进一步表明SZC015诱导细胞产生自噬的作用可能优于OA。(5)与空白对照组相比,经SZC015处理后,H322细胞中Akt、p-Akt、p-IκBα、P65和p-P65蛋白的表达水平均明显下降,且P65蛋白呈现出核转位现象,表明SZC015可通过调节Akt/NF-?B信号通路发挥抗肿瘤作用。(6)加入自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ),并在SZC015的作用下,与单独给药组相比,Procaspase-3蛋白表达明显下降,表明自噬可抑制凋亡。(7)与空白对照组相比,经SZC015处理后,H322细胞中ROS含量明显增多,表明SZC015能促进细胞内ROS生成。加入ROS清除剂(N-Acetyl-L-Cysteine,NAC)后,能使SZC015处理后的H322细胞中Procaspase-3和Akt蛋白表达呈现上升趋势,并能降低LC3B-II/I蛋白表达。结论:本研究发现SZC015能诱导NSCLC H322细胞发生细胞周期阻滞,细胞凋亡和细胞自噬现象,同时SZC015也可通过抑制Akt/NF-?B信号通路而抑制细胞增殖。结果表明SZC015具有潜在的用于治疗NSCLC的可能性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：1630783