转录因子SOX2通过JAGGED1促进人脐静脉内皮细胞增殖

发布时间：2018-04-10 18:36

本文选题：血管新生 + 人脐静脉内皮细胞　；参考：《吉林大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景:血管新生,是指从已有的血管形成新的血管的过程,在胚胎发育和组织再生中都是一个至关重要的过程,此外,血管新生也与多种疾病相关,如肿瘤、类风湿性关节炎。血管新生涉及多种细胞的多个过程,内皮细胞的变化是最主要的,而且贯穿始终。主要是内皮细胞接受缺氧细胞产生的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等物质传递来的信号后被活化从而导致了血管新生。血管新生过程需要一个唯一的特化形成的顶细胞,通过延伸出的动态伪足来探索周围的环境,引导血管新生的方向,而相邻的细胞通过细胞间的相互信号成为柄细胞,跟随其后增殖,形成管腔。随后相邻的出芽形成的血管相互熔断,连接,覆盖周细胞并灌注形成成熟的血管。VEGF和NOTCH通路形成的负反馈调节环路在顶-柄细胞的选择和维持中发挥了重要的作用。本课题组前期通过分析内皮顶细胞/柄细胞芯片数据构建转录网络发现,SOX2在这两种表型细胞转录中均处在关键节点位置,这提示我们SOX2可能在血管新生中发挥关键作用。前期实验中选择人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)为研究对象,因其可代表人体内绝大多数血管内皮细胞代谢和对外界生理、毒理反应的特征,被许多研究者作为内皮细胞模型。前期实验证明了在HUVEC中过表达SOX2能够促进内皮细胞的增殖能力,我们期望进一步明确转录因子SOX2促进增殖的分子机制,以丰富对血管新生机制的研究。方法:pcDNA3.0-SOX2质粒用脂质体转染HUVEC,并利用G418药物进行稳定筛选,后用有限稀释法获取单克隆,构建过表达SOX2的HUVEC。利用qPCR检测SOX2的转录水平,利用Western blot检测SOX2的蛋白表达水平。之后利用qPCR检测转染后NOTCH和VEGF通路中相关配体和受体分子的表达变化,初步筛选出差异表达的基因,Western blot进一步验证和筛选。之后对选出的分子进行染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP),Ch IP是研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法,验证是否是SOX2的直接靶基因。随后对选定的靶基因在过表达SOX2细胞中进行沉默,并用CCK8法、Ed U法、流式细胞术测定增殖能力。结果:脂质体转染pcDNA3.0-SOX2质粒,并利用G418药物进行稳定筛选,后用有限稀释法获取7株单克隆(后文用SOX2-n表示,n=1~7),转染空载组后文以EV(Empty vector)表示。经过qPCR鉴定,对比EV组和SOX2~+HUVEC组,其中4株有不同程度的高表达,有统计学差异(P0.05),选其中2株表达最高的细胞利用Western blot检测SOX2表达水平,SOX2-1、SOX2-2比EV组表达水平显著升高,有统计学意义(P0.001,P0.01)(后文用SOX2-1,SOX2-2表示),进行后续实验。利用qPCR,检测SOX2-1,SOX2-2中VEGF通路受体和配体的表达变化。结果显示,在SOX2-1中,NRP1表达降低,有统计学差异(P0.05),VEGFA,VEGFR1-3无统计学差异(P0.05)。在SOX2-2中,均无统计学差异(P0.05)。利用qPCR,检测SOX2-1,SOX2-2中NOTCH通路受体和配体的表达变化。结果显示,在SOX2-1中DLL4表达降低,JAGGED1表达升高,有统计学差异(P0.05),DLL1,DLL3,JAGGED2,NOTCH1,NOTCH2,NOTCH3,NOTCH4无统计学差异(P0.05)。在SOX2-2中,JAGGED1表达升高,有统计学差异(P0.05),DLL4,JAGGED2,NOTCH1,NOTCH2,NOTCH3,NOTCH4无统计学差异(P0.05)。利用Western blot,检测SOX2-1,SOX2-2中差异基因DLL4,NRP1,JAGGED1的蛋白表达水平。结果显示,JAGGED1表达高于EV组,有统计学差异(P0.05,P0.01),DLL4表达低于EV组,有统计学差异(P0.05),NRP1在SOX2-2中表达升高(P0.05),在SOX2-1中表达与EV组无统计学差异(P0.05)。查阅文献,获取三个基因与SOX2可能的结合信息,并未发现DLL4与SOX2相关的研究。因此通过Ensembl数据库获得NRP1,DLL4,JAGGED1的启动子区序列,并利用The Jaspar Database进行SOX2结合位点的在线预测。预测结果显示,JAGGED1有一个结合位点,NRP1有两个结合位点,而DLL4没有找到可能的结合位点,因此DLL4不做Ch IP-qPCR验证。利用Ch IP-qPCR验证SOX2对NRP1,JAGGED1的直接结合性,结果显示,SOX2组比阴性对照Ig G组富集了更多的JAGGED1启动子区片段,结果有统计学意义(P0.01),NRP1没有统计学差异(P0.05)。以上结果说明SOX2蛋白能够直接结合JAGGED1的启动子区发挥上调作用。前期研究证明了在HUVEC中过表达SOX2能够促进内皮细胞的增殖,我们想知道是否是通过JAGGED1发挥作用的。用三个慢病毒sh RNA-JAGGED1序列感染过表达细胞系SOX2-1,沉默JAGGED1,对照组为SOX2~+/Scrambled sh RNA(下文简写为SOX2~+/Scr sh RNA)。感染72h观察对照组和沉默组荧光,计数有荧光的细胞达到80%-90%。随后,利用qPCR和Western blot检测JAGGED1沉默效果,三个沉默组均出现了不同程度的降低,而三号序列沉默效果最强,因此使用三号细胞进行后续实验。用CCK8法检测细胞的增殖能力。结果表明,SOX2~+/JAGGED1-组的细胞增殖能力比SOX2~+/Scr sh RNA组低,有统计学意义(第2天P0.05,第3-7天P0.001)。通过计算得到细胞的群体倍增时间(population doubling time,PDT),SOX2~+/JAGGED1-组比对照组更长(P0.05)。Ed U法检测细胞的增殖能力,对照组处于增殖期的细胞比例高于对照组(P0.01)。流式细胞术检测细胞周期并计算细胞的增殖比例,也得到了类似的结果(P0.05)。在过表达SOX2的情况下,沉默JAGGED1,可以抵消部分SOX2过表达造成的增殖能力升高。这说明,在HUVEC中,转录因子SOX2至少部分通过上调其直接靶基因JAGGED1促进细胞增殖。结论:在HUVEC中,SOX2可以通过直接结合NOTCH通路配体JAGGED1启动子区发挥转录调控作用,并上调JAGGED1的表达。沉默JAGGED1可以部分阻断SOX2促进细胞增殖的作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R363

【参考文献】