重度慢性牙周炎患牙牙髓中牙髓间充质细胞生物学初步研究

发布时间：2018-12-07 14:25

【摘要】：目的利用重度慢性牙周炎患牙分离培养炎症牙髓间充质细胞;健康牙齿分离培养的牙髓间充质细胞作为对照组。体外进行MTT检测、与Bio-Oss骨粉复合培养、细胞膜片的制备、成骨诱导等相关检测,以对重度慢性牙周炎患牙牙髓中牙髓间充质细胞生物学特性初步研究。方法在临床收集重度慢性牙周炎患者因牙周破坏严重需要拔除的松动牙齿,同时收集临床患者需要拔除的健康阻生智齿作为对照组,利用组织块法体外分离培养牙髓间充质细胞。待原代细胞培养成功后利用胰酶消化进行传代培养,P3-P4代细胞用于实验室研究。在细胞培养基中加入系列浓度的维生素C(0,10,20,40μg/ml),利用MTT法检测其对细胞增殖的影响;将牙髓间充质细胞制备成1×10~6/ml的细胞悬液,细胞体外将牙髓间充质细胞与Bio-Oss骨粉复合培养,利用扫描电镜检测细胞与骨粉生物复合情况;利用MTT检测结果选择最适浓度的Vc体外诱导细胞膜片的形成,扫描电镜及HE染色检测细胞膜片组织情况;在体外对牙髓间充质细胞进行成骨诱导,通过茜素红染色、ALP活性检测及q PCR检测重度慢性牙周炎对患牙牙髓组织中炎性因子和骨代谢相关基因表达的影响。结果共收集25名重度慢性牙周炎患者拔除的患牙47颗,体外进行牙髓间充质细胞培养,细胞培养成功率为34/47(72%);对照组共收集3位患者因阻生需要拔除的健康智齿进行牙髓间充质细胞培养,细胞培养成功率为100%。牙周炎组和健康组的原代细胞从组织块爬出的时间分别为7-14天和3-5天。MTT检测提示两组细胞增殖能力无明显区别,Vc对于牙髓间充质细胞的增殖影响具有浓度依耐性,当Vc浓度为20μg/ml时可明显促进细胞的增殖(P0.05),但是当Vc浓度增加到40μg/ml时,可明显抑制细胞的增殖(P0.05)。当细胞达到近融合后,利用20μg/ml的Vc对细胞进行连续培养2-3周后,两组细胞均可形成完整的细胞膜片。对两组细胞膜片倒置显微镜下观察、HE染色检测、扫描电镜检测可见细胞复层生长,细胞间紧密连接,有大量细胞间质保留,两组细胞膜片的镜下形态无明显区别。体外将细胞与骨粉复合培养一周后形成生物复合物,扫描电镜检测可见两组细胞均可以黏附生长于骨粉上,形态良好。对两组细胞进行体外成骨诱导,茜素红染色提示均可见明显的成骨结节;ALP活性检测提示其随着成骨诱导时间增加,其ALP活性增强。q-PCR检测两组细胞炎性因子和骨代谢相关基因提示:相对于健康牙髓间充质细胞,牙周炎组牙髓间充质细胞的IL-1β,IL-6,IL-8,和TNF-α的m RNA相对表达量明显较高,差异有统计学意义(P0.001)。经成骨诱导后,两组细胞的成骨相关基因(ALP,OCN,BMP2,RUNX2)均出现明显上调(P0.05),组间比较发现,相对于健康牙髓间充质细胞,炎症牙髓间充质细胞的成骨基因表达较低(P0.05)。结论因重度慢性牙周炎致牙周破坏严重无法保留的患牙,在体外依然可以分离培养出牙髓间充质细胞,且其与正常牙髓间充质细胞具有相似的增殖能力及形成细胞膜片能力;经与骨粉复合培养后能在骨粉上粘附生长;体外成骨诱导后,可形成明显的成骨结节,但与正常牙髓间充质细胞相比,其成骨能力较低。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.42

【参考文献】