Mafb及其蛋白表达在尿道下裂发病机制中的初步研究

发布时间：2020-11-02 09:31

　　 背景:尿道下裂是男性常见的先天性外生殖器畸形之一,主要表现为尿道开口异位,即尿道口从远端阴茎头部向近端阴茎根及阴囊移位,常伴随腹侧包皮缺失和阴茎下弯畸形。其发病率较高,每200-300个新生男婴中可发生一例,且呈逐年增长趋势。尿道下裂的唯一治疗方法是手术矫正畸形,但包括尿瘘、尿道狭窄在内的术后并发症常无法避免,严重者导致成年后性功能障碍、排尿困难及心理疾病。目前尿道下裂的病因不明,认为与环境、遗传、激素以及内分泌等多种因素共同影响相关,环境内分泌干扰物是目前研究的热点。在邻苯二甲酸盐类(PEs)中,邻苯二甲酸二已酯(DEHP)在塑料生产加工中应用广泛,这种环境内分泌干扰物已经证实能够诱导雄性生殖系统的发育异常,但其发生机制仍待深入研究。作为发挥生物功能作用蛋白质与遗传信息载体基因连接的纽带,转录组具有快速全面获取特定组织在特定状态下的几乎所有基因序列及转录本的优点,能提供全面的转录组信息,广泛应用于医学领域。雄激素、雄激素受体及相关信号通路在尿道雄性化过程中发挥着重要作用,其异常表达与尿道下裂的发生相关。肌腱膜纤维肉瘤基因B型(Mafb)属于Maf家族,研究表明它不仅在细胞的增殖、分化及器官的发生中发挥着重要作用,也与雄性泌尿生殖器发育相关,但作用机制研究尚不明确。目的:本研究旨在通过对GD16与GD19大鼠胎鼠阴茎进行转录组测序,初步筛选正常尿道发育过程中的一些关键基因和重要的信号传导通路,进一步筛选出与雄激素相关的差异基因Mafb进行验证,探究Mafb及其相关蛋白在DEHP致大鼠尿道下裂及尿道下裂病人包皮组织中的表达差异。方法:40只成年SD孕鼠随机分成4组(n=10),前两组予以空白对照处理,分别于妊娠期16d(GD16组)和妊娠期19d(GD19组)剖宫产取出雄性胎鼠,将收集好的胎鼠阴茎组织进行转录组测序,lllumina HiSeq 2000筛选出差异表达基因(DEGs),然后对DEGs进行差异基因功能(GO)和pathway显著富集性分析;选取其中的DEG(Mafb)进行免疫荧光验证。后两组分别予以玉米油(对照组)和DEHP[750mg/(kg.d)](DEHP暴露组)于GD12d至GD19d每日灌胃处理,GD19d剖宫产取出雄性胎鼠,并判断有无尿道下裂的发生。扫描电镜和HE染色观察阴茎组织形态学改变,免疫荧光和western blot检验阴茎组织中Mafb、β-catenin的表达水平。同时,收集正常儿童包皮组织,轻度尿道下裂患儿及重度尿道下裂患儿包皮组织各15例,检测Mafb及其相关蛋白的表达。结果:GD19组胎鼠阴茎组织与GD16组胎鼠阴茎组织转录组测序结果示1360个DEGs(其中上调797个,下调563个),差异基因主要富集于细胞粘着斑信号通路、轴突导向信号通路、细胞外基质受体作用信号通路等,选取DEG(Mafb)进行免疫荧光验证,发现Mafb的表达随发育显著增加,与测序结果相符。而DEHP暴露组胎鼠阴茎组织与对照组胎鼠阴茎组织相比,Mafb、β-catenin表达水平显著下调(P0.05)。尿道下裂包皮组织中Mafb表达较正常包皮组织显著下调,而与Mafb相关蛋白c-Fos表达显著增高。结论:随着大鼠阴茎组织的正常发育,Mafb的表达逐渐增加;而DEHP暴露组较对照组Mafb、β-catenin表达显著下调,提示β-cateninMafb信号通路异常表达可能与DEHP诱发大鼠尿道下裂发生相关。Mafb表达降低及其相关蛋白c-fos的上调可能与人尿道下裂发生相关。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R726.9
【部分图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文17图1.1差异基因统计图及差异基因表达散点图Fig.1.1Statisticsandscatterplotofthedifferentiallyexpressedgenes(DEGs).差异基因数量及散点图，黄色标注的是显著性上调基因，蓝色标注的是显著下调基因。2.2.2差异表达基因的基因数量以P值小于0.05且差异倍数至少两倍以上为条件对数据进行差异基因表达筛眩结果如图1.1所示，在GD16组及GD19组之间共识别有1360个DEGs，其中上调差异基因797个，下调差异基因563个。列举了部分差异基因，如表1.1所示。表1.1部分上调和下调差异基因名称及差异倍数Table1.1Statisticsofsomeoftheup-regulatedanddown-regulatedgenes(DEGs)IDSymbolDescriptionlog2Ratio(GD19/GD16)P-valueUp-Down*499744Il36ginterleukin36,gamma16.660803738.61E-267Up502143Idi2isopentenyl-diphosphatedeltaisomerase216.40988811.88E-105Up64389Defb4defensinbeta415.958779253.40E-45Up691018Hsd17b14hydroxysteroid(17-beta)dehydrogenase1415.124040511.62E-52Up310575Sprr3smallproline-richprotein315.065079496.95E-47Up60325Serpinb2serpinpeptidaseinhibitor,cladeB(ovalbumin),member214.379919827.40E-78Up

重庆医科大学硕士研究生学位论文192.2.3差异基因显著性富集分析2.2.3.1差异基因GO富集分析GO功能显著性富集分析能够给出同基因组背景比较，显著富集于差异表达基因中的GO功能条目，从而找出差异基因表达同哪些生物学功能相关。GO功能条目的获得主要是基于GO数据库对差异表达基因进行注释，主要从三个层面进行：生物学过程（BiologicalProcess,BP）、分子功能（MolecularFunction,MF）和细胞组分（CellularComponent,CC）。对GD19组与GD16组进行DEGsGO富集分析，结果发现DEGs功能涉及多方面及多个信号通路，列举前20条通路，DEGs显著富集可见于细胞外基质受体相互作用、蛋白质消化吸收、肾素-血管紧张素系统、粘着斑、视黄醇代谢和PPAR信号通路等方面，见图1.2。图1.2差异基因的GO功能显著性富集分析Fig.1.2GOfunctionalclassificationofDEGs2.2.3.2差异基因KEGG富集分析DEGs的Pathway注释主要是在KEGG数据库基础上完成。使用Fisher法检

重庆医科大学硕士研究生学位论文20验分析pathway的显著差异表达水平，P值小于0.5视为表达有显著差异。然后通过富集差异基因的条目，进而找出各组间样品间差异表达基因同哪些信号通路的改变相关。实验结果显示DEGs主要富集于细胞外基质受体相互作用、肾素-血管紧张素系统、蛋白质消化吸收、粘着斑、视黄醇代谢和PPAR信号通路等方面，见图1.2。在此基础上，将显著差异表达基因相关的KEGG通路与GO生物学过程进行绘图展示。对差异基因数目超过2的pathway条目，根据各个条目对应的-log10Pvalue大小从大到小依次筛选排序，绘制出上调和下调Top20的KEGG富集分析气泡图。纵坐标为生物学过程和通路名称，纵坐标为richfactor，指富集于此pathway条目的基因数量同所有注释基因中位于此pathway条目的基因总量的比值。气泡大小代表DEGs数量的多少，越大表明所包含的DEGs数目越多；颜色深浅代表富集的显著程度，颜色越深代表P值越小，富集越显著。见图1.3。图1.3Pathway富集统计散点图Fig.3StatisticsofpathwayenrichmentforGD16-vs-GD19(top20)（纵坐标表示生物学过程和通路名称，横坐标表示richfactor,气泡越大代表包含的差异基因数目越多，颜色越深，其富集P值越小，富集越显著）
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 曾莉;王玉芸;张洁;林苹;龚学德;黄鲁刚;;敌敌畏对大鼠睾丸Leydig细胞凋亡的影响[J];中华男科学杂志;2009年11期

本文编号：2866866