基于阻断剂引发的超支化滚环扩增法富集和检测DNA稀有突变

发布时间：2020-11-05 05:19

　　 基因突变是癌症诊断和监视的重要生物标志物,灵敏地识别单核苷酸变异有助于实现精准医疗。现有的检测方法包括测序、探针杂交、基于引物延伸的扩增反应、基于酶特异性识别的酶切技术及连接反应等,存在着诸多不足,如需要热循环、昂贵的仪器、精确的温度控制、专业的技术人员、灵敏度和特异性不足等等。针对上述问题,本论文以阻断剂置换放大扩增系统(BDA)和超支化滚环扩增(HRCA)技术为基础,创新性地提出了一种新的灵敏、简便、廉价和高特异性的单核苷酸变异等温扩增和检测方法,主要研究内容如下:首先提出检测原理并实验验证该方法的可行性,针对引物2和dNTP浓度进行条件优化,并通过实验测定了该方法检测DNA单碱基变异的性能。结果表明,在突变型和野生型基因中加入同野生型完全匹配的阻断剂后,锁式探针3'端可以与阻断剂进行合理的竞争杂交,从而导致大量的锁式探针与突变型靶标杂交并延伸,以“间隙—填充”形式连接成环,而只有少量的野生型对应的锁式探针可以成环;然后在引物1的作用下扩增出一条长的ssDNA产物,引物2与阻断剂在这条长链上继续竞争杂交,最终实现选择性等温扩增突变型靶标,可以检测到等位基因频率为0.1%的已知或未知单核苷酸变异。该方法从原理上克服了常规热力学检测单碱基差异核酸时的温度敏感性,解决了PCR需要热循环和专业技术人员、昂贵的缺点,为低丰度未知或已知单碱基变异的检测提供了新的方向。其次实验证明该方法可以应用于集群癌症突变的扩增,并且能够检测到细胞中提取的基因组DNA中的0.1%的KRAS单碱基变异,实验结果通过桑格测序得到完美验证。对促进体外诊断和精确临床治疗的发展具有重要意义,为资源匮乏地区的护理点诊断提供了新的依据。最后提出原位检测细胞KRAS突变表达的mRNA原理及方法,设计了dsDNA的直接检测,并初步取得mRNA原位成像效果,为细胞原为检测提供了新思路。由于局部环境不同、细胞异质性和迁移,该方法提供单分子水平的灵敏度以及超高特异性,预计将促进利用mRNA突变作为生物标志物进行诊断的相关生物医学研究的发展。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R440
【部分图文】：

华东师范大学硕士学位论文第一章2据估计，2018年全球癌症发病率和死亡率中，肺癌作为最常见的癌症，占总病例的11.6%，是癌症死亡的主要原因（占癌症死亡总数的18.4%），其次是女性乳腺癌（11.6%）、前列腺癌（7.1%）、结直肠癌（6.1%）、大肠癌（9.2%）、胃癌（8.2%）和肝癌（8.2%）[63]。据中国疾控中心（CDC）估计，在我国多项疾病致死原因中，癌症高居第二位，只低于心血管疾病，并且每年有三百多万的新生癌症病例和二百多万死亡病例。而造成癌症的大部分原因是各种物理、化学等外界因素和遗传、生活习惯等内在因素的长期影响，导致人体细胞中的基因受到损伤或发生改变，也就是常说的基因突变。图1.12015年70岁以下癌症死因分布的全球地图[63]根据世卫组织（WHO）的建议，癌症的发现时间很大程度上会影响癌症的治疗效果和生存率，如果能够实现癌症的早期诊断，估计可有效延长1/3患者的生命，并且能够完全治愈1/3的患者。因此早诊断早治疗就成为提高癌症治愈率的关键。

华东师范大学硕士学位论文第一章5行比色测定。虽然AS-PCR技术在选择性扩增和靶序列检测方面有出色的表现，但是其有限的复用能力、引物二聚体的形成和昂贵的热循环仪限制了其发展。图1.2通过硫醇标记的引物引发等位基因特异性PCR的SNP分型示意图[15]单碱基延伸（SBE）Goelet等人于1999年提出了单碱基延伸法，他们将引物的3"端设计在DNA模板的SNV位点上，并引入四种双脱氧核苷酸（ddATP、ddTTP、ddGTP和ddCTP），在DNA聚合酶的作用下，引物3"端延伸出与目标SNV互补的单个双脱氧核苷酸（ddNTP）。因为双脱氧核苷酸缺乏链延伸所必需的3"端羟基基团，一旦将双脱氧核苷酸添加到引物中就不会发生进一步的链延长[16,17]。通过不同的检测技术，如荧光法[18]、MALDI-TOF质谱[19]、凝胶电泳[20]等来确定掺入核苷酸的种类来鉴别SNV。例如，Xu等人[18]开发了一种基于GO对荧光素标记的dGTP（dGTP-F1）和双链DNA（dsDNA）的单碱基延伸反应的不同吸收能力的新型荧光SNP检测方法（图1.3）。dGTP-F1通过延伸反应掺入到突变型目标匹配的探针中，由于dsDNA和GO之间的相互作用较弱，导致突变型目标恢复了荧光；而由于野生型和探针不匹配，不能进行延伸，GO对dGTP-F1的荧光有淬灭作用而使野生型目标的荧光减弱。其检测线性范围为3nM-50nM，在野生型的存在下可以检测到低至10％的突变型目标。

华东师范大学硕士学位论文第一章6图1.3氧化石墨烯（GO）-SNP传感原理图[18]1.2.2.2基于探针杂交的检测技术DNA杂交探针提供了检测互补核酸靶标的简单方法，通过使用严格的Watson-Crick碱基配对规则提高检测速度和准确性。但因为SNV与野生型对应物之间的热力学差异仅为几千卡/摩尔，除了在DNA的解链温度Tm附近，完美互补的结合在能量上比错配链的结合更有利，在其他温度下传统的杂交探针的靶结合活性可能是非特异性的[21]。尽管可以通过杂交或在随后的杂交Tm附近的洗涤步骤获得单碱基特异性[22]，该方法的实际实施仍然涉及三个主要挑战。首先，需要大量的投资用于多次实验验证和条件优化，因为需要为每个新的待测物寻找最佳温度；其次，这种方法的复用能力有限，并且当必须在相同条件下同时分析各自具有不同的Tm的多个目标时，这些方法可能无效；最后，即使在优化的反应条件下，杂交亲和力中位数差异也只在5到26之间[23-26]。为了克服这些限制，已经进行了许多尝试来设计杂交探针，使杂交探针在更宽的温度范围内具有改善的结合特性和对单碱基错配的更高特异性。这些增强的杂交探针是通过缩短探针的序列长度、化学修饰探针或对探针施加约束（如发夹探针）来开发的。短杂交探针通过减小杂交探针的长度，可以显著提高依赖于完美匹配和不匹配链之间差异杂交的SNV鉴别方法的选择性。这是因为在碱基对较少的双链体中，单碱基错配的去稳定作用更为明显，这使得探针与错配序列的结合在热力学上不利
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本文编号：2871186