布鲁氏菌MLVA种型分布及布鲁氏菌重组鞭毛蛋白融合表达、免疫原性研究

发布时间：2020-11-05 05:55

　　 目的:(1)通过多位点可变数目串联重复序列分析方法(multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)研究世界多个国家和地区分离的布鲁氏菌的分子流行病学特征;(2)通过检测布病患者血清中白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素8(IL-8)和肿瘤坏死因子a(TNF-a)的水平,探讨免疫相关因子IL-2、IL-8和TNF-a与布病的相关性;(3)分别构建含布鲁氏菌基因组目的基因FlgE、BLS-FlgE、FlgL和BLS-FlgL的原核表达载体,表达纯化重组蛋白,并对FlgE和BLS-FlgE蛋白的布病诊断价值进行初步评价。方法:(1)选择11个可变数目重复序列(variable-number tandem-repeat,VNTR)位点,使用BioNumerics软件,采用非加权配对算术平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean,UPGMA),对1953年至2013年间全球48个国家和地区分离的布鲁氏菌VNTR资料进行聚类分析,绘制系统发育树和最小生成树(minimum spanning tree,MST),以及菌株的流行分布特征;(2)ELISA法测定布病患者血清和正常人血清IL-2、IL-8和TNF-a的水平,分析免疫相关因子与布病的关系;(3)从NCBI得到布鲁氏菌鞭毛蛋白基因FlgE、FlgL和2,4二氧四氢蝶啶合酶基因(BLS)序列,设计引物,利用PCR技术扩增得到目的基因,连接载体pET30a,转化Ecoli BL21感受态细胞,使用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定,用带His标签的蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。纯化后的FlgE鞭毛蛋白和BLS-FlgE融合蛋白建立间接酶联免疫吸附测定法(indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay,iELISA)检测布病阳性血清和健康人血清,计算iELISA方法的灵敏度和特异度。结果:(1)布鲁氏菌系统发育树的进化关系与经典的生物分型方法基本上吻合,但猪种生物5型菌株与其它猪种生物1、2、3和4型菌株关系较远;鲸种布鲁氏菌也分为两个部分,并且关系较远。通过聚类分析布鲁氏菌增加东非、西非、南非和亚洲谱系。中国是布病多发区,主要流行株为羊种布鲁氏菌,其次是牛种布鲁氏菌,猪种布鲁氏菌主要出现中国南部省份,犬种布鲁氏菌只在动物中犬中出现,人类中没有出现。(2)布病患者血清IL-2水平低于正常人,而IL-8和TNF-a水平则高于正常人,差异有统计学意义(P0.05)。Spearman相关分析显示IL-8和TNF-a之间存在正相关(P0.05)(3)成功克隆了FlgE鞭毛蛋白、FlgL鞭毛蛋白、BLS-FlgE融合蛋白和BLS-FlgL融合蛋白,经过优化表达条件,目的蛋白获得较大量的表达,免疫印迹结果显示可被阳性病人血清识别。以FlgE蛋白构建iELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为70.83%和41.67%,以BLS-FlgE蛋白构建iELISA法检测得到灵敏度和特异度分别为68.75%和52.08%。结论:(1)布鲁氏菌具有种的系统发育树特征,并且具有分离的时间、地域和宿主的特异性;(2)布病与免疫细胞因子IL-2、IL-8和TNF-a水平相关。推测IL-8和TNF-a存在协同作用。(3)成功表达布鲁氏菌FlgE鞭毛蛋白、FlgL鞭毛蛋白、BLS-FlgE融合蛋白和BLS-FlgL融合蛋白,以FlgE鞭毛蛋白和BLS-FlgE融合蛋白分别作为诊断抗原灵敏度较高而特异度低,具有早期诊断价值。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R378.5
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文4表12747株布鲁氏菌的分离宿主、种型及菌株数量关系表宿主菌株生物型菌株数宿主菌株生物型菌株数麂牛种1型1驯鹿猪种3和4型8家鼠牛种1型1蟾蜍牛种1和3型15假水蚤羊种3型1鲸鱼鲸种28沙漠鼠沙林鼠种1野兔猪种1和2型30麝牛猪种4型1山羊牛种1型、猪种1和2型39水獭鳍种1海豚鲸种和鳍种42红狐猪种5型2海豹B鲸种和鳍种53马猪种1型2野猪猪种1和2型133田鼠田鼠种2犬犬种、羊种1型和牛种3型134麋鹿牛种1型3家猪猪种和羊种3型137土壤田鼠种3绵羊羊种、牛种、猪种和绵羊附睾种200骆驼牛种3型4牛牛种、羊种和猪种593牦牛牛种和羊种4人类牛种、猪种、鲸种、犬种和B.inopinata874来源不详435图1布鲁氏菌分离地区与菌株的关系

布鲁氏菌分离时间与菌株的关系

布鲁氏菌分离来源与菌株的关系
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本文编号：2871224