烟曲霉Bem46基因荧光定位株的观察及对极性生长相关基因影响作用的初探

发布时间：2020-11-09 03:59

　　 目的:极性生长普遍存在于真核生物形态发生的过程中,真菌是极性生长模式研究的理想生物,真菌的极性生长过程及其复杂。本文首先通过已构建的烟曲霉Bem46-eGFP菌株小培养观察了该基因在烟曲霉孢子及其萌发状态时在激光共聚焦显微镜下荧光的分布情况;其次通过实时荧光定量PCR对比标准株Ku80和Bem46缺陷株中极性生长相关基因的表达量,初步探索bem46基因在烟曲霉极性生长过程中可能的机制。方法:首先分别活化烟曲霉标准株Ku80、△Bem46和Bem46-eGFP菌株(后两株菌本团队在前期工作已构建完成)。配置Bem46-eGFP菌株孢子混悬液,定量,分别经GMM培养基培养0h及7h后置于激光共聚焦显微镜下观察孢子及其萌发状态下荧光的定位情况。然后分别提取标准株和△Bem46的总RNA,经逆转录形成cDNA,最后通过实时荧光定量PCR方法比较极性生长相关基因gel1、gel2、gel4、crzA、cdc42及rsr1在这两株菌中的相对表达量。结果:通过激光共聚焦显微镜观察发现,Bem46-eGFP菌株在孢子状态下荧光聚集在孢子部位,而当菌株萌发至有芽管出现时,荧光聚集在孢子的发芽及出现芽管的部位;△Bem46菌株中,gel1基因的表达量约为标准株的0.43倍,gel2基因的表达量约为标准株的0.18倍,cdc42基因的表达量约为标准株的0.19倍,crzA基因的表达量约为标准株的0.30倍,上述基因表达量均下调;gel4基因的表达量约为标准株的0.95倍,表达量无明显变化;rsr1基因的表达量约为标准株中3.49倍,表达上调。结论:bem46基因可能参与烟曲霉孢子的均质生长及孢子极性生长位点的选择,推测其类似于粗糙脉孢菌可能是通过向发芽及分支部位聚集生长素等营养物质进行的,尚待进一步验证;烟曲霉bem46基因的缺失导致极性生长相关基因gel1、gel2、cdc42及crzA的表达下调,使rsr1基因表达上调,对gel4基因表达无明显影响,推测bem46基因可能是通过参与各目的基因相关的细胞壁完整性途径、钙-钙调神经磷酸酶途径、极性位点的选择等方面来影响目的基因的表达量,但其具体机制有待进一步探索。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R379.6
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文62结果通过激光共聚焦显微镜观察发现，Bem46-eGFP菌株在孢子状态下荧光基本均匀分布在孢子部位，（见图1），而当菌株萌发至有芽管出现时，荧光聚集在孢子萌发部位及芽管部位（见图2）。图1（共聚焦油镜，×600）：烟曲霉Bem46-eGFP孢子状态下荧光的分布，左侧为明场条件下，右侧为荧光激发状态下，两图拍摄为同一视野，可见荧光基本均匀分布在孢子位置。图2（共聚焦油镜，×600）：烟曲霉Bem46-eGFP孢子发芽至芽管出现时荧光的分布，左侧为明场条件下，右侧为荧光激发状态下，两图拍摄为同一视野，可见荧光聚集在孢子发芽及芽管部位。

山西医科大学硕士学位论文62结果通过激光共聚焦显微镜观察发现，Bem46-eGFP菌株在孢子状态下荧光基本均匀分布在孢子部位，（见图1），而当菌株萌发至有芽管出现时，荧光聚集在孢子萌发部位及芽管部位（见图2）。图1（共聚焦油镜，×600）：烟曲霉Bem46-eGFP孢子状态下荧光的分布，左侧为明场条件下，右侧为荧光激发状态下，两图拍摄为同一视野，可见荧光基本均匀分布在孢子位置。图2（共聚焦油镜，×600）：烟曲霉Bem46-eGFP孢子发芽至芽管出现时荧光的分布，左侧为明场条件下，右侧为荧光激发状态下，两图拍摄为同一视野，可见荧光聚集在孢子发芽及芽管部位。

山西医科大学硕士学位论文14由图3、5、7、9、11、13可知各目的基因均呈典型的“S”型扩增，因本实验使用的是SYBR方法，可能对于杂质或引物二聚体也进行非特异性扩增，故需对每个目的基因进行熔解曲线分析确保没有引物二聚体等其他杂物，从图4、6、8、10、12、14可以看出各目的基因均有一单个熔解峰值，说明实验中未检测到其他副产物，各目的基因扩增良好。图3gel1基因及内参基因的扩增曲线图4gel1基因及内参基因的熔解峰图图5gel2基因及内参基因的扩增曲线
【参考文献】

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1 吕运通;王文岭;;真菌极性生长结构的研究现状[J];中国真菌学杂志;2012年02期

本文编号：2875850