激活前扣带皮层κ-阿片受体抑制NMDA电流的膜片钳研究
发布时间：2020-11-10 13:08
目的:疼痛是患者求医最常见的原因之一。尽管不会立即威胁生命,但慢性疼痛会使人遭受巨大的痛苦。国际疼痛协会对疼痛的最新定义为“疼痛是一种由组织损伤或潜在的组织损伤引起的相关感觉、情绪、认知和社会维度的痛苦体验”。疼痛的感觉分辨和情绪体验由不同的神经通路传导。大量研究表明,ACC参与编码痛情绪反应。离子型谷氨酸受体包括NMDA受体和非NMDA受体(AMPA和KA受体),其中NMDA受体被认为参与疼痛的情感维度的处理。阿片受体是镇痛、成瘾和情绪障碍的重要药物靶标。ACC脑区中的阿片受体主要有μ-、δ-和κ-阿片受体。本实验室的前期研究从行为学、蛋白水平以及多通道电生理记录证实了大鼠脚掌注射CFA可引起ACC脑区NMDA受体磷酸化水平增高,神经元的兴奋性升高,从而诱导大鼠的痛厌恶情绪;激活ACC脑区κ-阿片受体,可下调NMDA受体的磷酸化水平,降低神经元的兴奋性,缓解痛厌恶情绪。然而,脚掌注射CFA引起ACC脑区神经元兴奋性增强是否为NMDA电流增强所致?激活κ-阿片受体后是否通过抑制了NMDA电流降低了神经元的兴奋性?目前还没有确切的证据。因此,本研究旨在利用给大鼠脚掌注射CFA建立的慢痛模型,利用脑片膜片钳技术记录大鼠ACC脑区神经元NMDA电流的变化,进一步探讨ACC脑区神经元兴奋性与NMDA电流变化的关系,以及激活κ-阿片受体对NMDA电流的影响。方法:1.选取雄性SD大鼠(10~20天),脚掌注射0.08 ml完全弗氏佐剂(CFA)混合液,建立炎性疼痛模型。对照组相同部位注射0.08 ml生理盐水(NS)。2.制备SD大鼠包含ACC区域的脑片(250μm),利用可视膜片钳法选择状态好的神经元。将细胞膜电位钳制在+40mV,利用刺激电极诱导并记录其NMDA电流,比较CFA组大鼠与对照组大鼠NMDA电流的幅度是否有差异。3.将细胞膜电位钳制在+40mV,利用刺激电极诱导并记录ACC脑区神经元的AMPA电流,比较CFA组大鼠与对照组大鼠AMPA电流的幅度是否有差异。4.在Gap-free模式下记录ACC脑区锥体神经元的自发性兴奋性突触后电流(sEPSP),比较CFA组大鼠与对照组大鼠sEPSP的发放频率与幅度是否有差异。5.在脑片灌流液中添加不同浓度(10~-1212 mol/L、10~-99 mol/L、10~-66 mol/L)的κ-阿片受体激动剂Dynorphin A,观察其对CFA组大鼠ACC脑区神经元的NMDA电流及AMPA电流的影响。6.在电极内液中添加荧光染料使神经元着色,观察所记录细胞的形态。结果:1.将膜电位钳制在+40 mV时,刺激电极可诱导大鼠ACC脑区神经元产生外向电流。向灌流液中加入AMPA/KA受体拮抗剂CNQX(20μmol/L)和GABA受体拮抗剂Bicuculline(100μmol/L),电流幅度部分减小;再向灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP-5(100μmol/L),可见电流被全部抑制,说明后一部分被AP-5抑制的电流为NMDA电流。若向灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP-5(100μmol/L)和GABA受体拮抗剂Bicuculline(100μmol/L),电流大部分被抑制;再向灌流液中加入AMPA/KA受体拮抗剂CNQX(20μmol/L),可见电流被全部抑制,说明后一部分被CNQX抑制的电流为AMPA电流。2.将膜电位钳制在+40 mV,灌流液中加入AMPA/KA受体拮抗剂CNQX(20μmol/L)和GABA受体拮抗剂Bicuculline(100μmol/L)后,可记录到刺激电极诱导的大鼠ACC脑区神经元的NMDA电流。脚掌注射CFA组大鼠与对照组大鼠相比,ACC脑区神经元的NMDA电流的幅度显著增加(P0.05,n=5)。3.将膜电位钳制在+40 mV,灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP-5(100μmol/L)和GABA受体拮抗剂Bicuculline(100μmol/L),可记录到刺激电极诱导的ACC脑区神经元的AMPA电流。脚掌注射CFA组大鼠与对照组大鼠相比,ACC脑区神经元的AMPA电流的幅度改变无统计学差异(P0.05,n=5)。4.Gap-free模式下记录细胞的自发性兴奋性突触后电流(sEPSP),CFA组大鼠与对照组大鼠相比ACC脑区神经元的sEPSP的发放频率与幅度显著增加。5.选取CFA组大鼠脑片中的细胞,将膜电位钳制在+40 mV下,灌流液中加入AMPA/KA受体拮抗剂CNQX(20μmol/L)和GABA受体拮抗剂Bicuculline(100μmol/L)后,可记录到刺激电极诱导的大鼠ACC脑区神经元的NMDA电流。灌流液中加入不同浓度的κ-阿片受体激动剂Dynorphin A,发现10~-1212 mol/L的Dynorphin A对NMDA电流没有明显影响;10~-99 mol/L的Dynorphin A可降低CFA组大鼠NMDA电流的幅度(P0.05,n=5),10~-66 mol/L的Dynorphin A降低CFA组大鼠NMDA电流幅度的效果更显著(P0.01,n=5),说明随着κ-阿片受体激动剂浓度的增加,NMDA电流被抑制的程度也逐渐增加。6.选取CFA组大鼠脑片中状态好的细胞,将膜电位钳制在+40 mV,灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP-5(100μmol/L)和GABA受体拮抗剂Bicuculline(100μmol/L)后,可记录到刺激电极诱导的大鼠ACC脑区神经元的AMPA电流。灌流液中加入不同浓度(10~(-12)mol/L、10~(-9)mol/L、10~(-6)mol/L)的κ-阿片受体激动剂Dynorphin A对CFA组大鼠AMPA电流的影响无统计学差异(P0.05,n=5),说明激活κ-阿片受体对AMPA电流无明显作用。7.大鼠ACC区域的脑片荧光染色后可清晰地观察到实验中所记录神经元的胞体、轴突及树突呈现绿色荧光。结论:大鼠脚掌注射CFA引起ACC脑区NMDA受体(而不是AMPA受体)介导的电流幅度显著增加,是提高该区域神经元兴奋性的原因;而激活κ-阿片受体减小NMDA电流的幅度,可降低神经元的兴奋性。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R402
【部分图文】：
山西医科大学（博）硕士学位论文6温（25℃）孵育液中。切片液和孵育液中都持续通混合气（95％O2和5％CO2）。切好的脑片孵育1小时即可观察记录。如图1所示。图1大鼠离体脑片标本制备A：将大鼠断头，掀起颅骨，剥去脑膜后取出的脑组织；B：用刀片切去多余部分后的脑组织；C：用冰夹使溶解状态的琼脂凝固从而固定脑组织；D：沿冠状切面切取脑片，切片槽周围放置冰袋降温，切片液中持续通混合气（95％O2和5％CO2）。1.5.3微电极的拉制微电极所用的玻璃管选择美国Sutter公司的硼硅酸盐玻璃管，外径为1.5mm，内径为0.86mm，带芯，有利于充灌电极尖端。在P-97微电极拉制仪上设置相应参数，首先对玻璃、管进行坡度测试，然后在此基础上设置加热值、气体压强、拉制杆移动速度、制冷空气释放的时间长度等。采用三步拉制法，将玻璃管拉成尖端较胖的电极，易于封接。用事先配置好的电极内液充灌时，先在电极靠后的部分注入少许内液，利用虹吸作用使尖端充满，之后再将内液充灌到电极的1/3处，指尖轻弹电极，去除电极尖端残留的气泡，测试电极的阻抗，在5～8MΩ，即为适合实验记录的玻璃微电极。1.5.4脑片膜片钳记录膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个
山西医科大学（博）硕士学位论文92结果2.1刺激电极可诱导大鼠ACC脑区神经元的NMDA电流和AMPA电流将膜电位钳制在+40mV下时，刺激电极可诱导大鼠ACC脑区神经元的外向电流。在灌流液中加入AMPA受体拮抗剂CNQX（20μmol/L）和GABA受体拮抗剂Bicuculline（100μmol/L），可记录到较大的电流；继续加入AP-5（100μmol/L），可见电流被全部抑制，冲洗掉AP-5后电流恢复，证明该电流为NMDA电流，如图2所示。若在灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP-5（100μmol/L）和GABA受体拮抗剂Bicuculline（100μmol/L），可记录到一较小电流；继续加入AMPA受体拮抗剂CNQX（20μmol/L），可见该电流被全部抑制；冲洗掉CNQX后电流恢复，证明该电流为AMPA电流。如图3所示。图2刺激电极诱导的大鼠ACC脑区NMDA电流A：将膜电位钳制在+40mV，刺激电极诱导的ACC脑区神经元的外向电流；B：膜电位钳制在+40mV，脑片灌流液中添加AMPA受体拮抗剂CNQX和GABA受体拮抗剂Bicuculline后的所钳制细胞的电流变化；C：在B的基础上向脑片灌流液中添加NMDA受体拮抗剂AP-5后所钳制细胞的电流被完全抑制；D：冲洗掉AP-5后电流恢复。
山西医科大学（博）硕士学位论文10图3刺激电极诱导的大鼠ACC脑区AMPA电流A：膜电位钳制在+40mV，刺激电极诱导的ACC脑区神经元的外向电流；B：膜电位钳制在+40mV下，脑片灌流液中添加NMDA受体拮抗剂AP-5和GABA受体拮抗剂Bicuculline后所钳制细胞的电流变化；C：在B的基础上向灌流液中添加AMPA受体拮抗剂CNQX后电流被完全抑制；D：冲洗掉CNQX后电流恢复。2.2CFA组大鼠ACC脑区神经元NMDA电流幅度增加脑片灌流液中加入AMPA受体拮抗剂CNQX（20μmol/L）和GABA受体拮抗剂Bicuculline（100μmol/L），将细胞膜电位钳制在+40mV，可记录到ACC区神经元的NMDA电流。CFA组大鼠与NS组大鼠ACC区神经元NMDA电流的幅度相比明显减小（CFA组372.6±26.72pAvs对照组258.6±40.38pA，P<0.05，n=5），如图4所示。
【参考文献】
本文编号：2877964
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R402
【部分图文】：
山西医科大学（博）硕士学位论文6温（25℃）孵育液中。切片液和孵育液中都持续通混合气（95％O2和5％CO2）。切好的脑片孵育1小时即可观察记录。如图1所示。图1大鼠离体脑片标本制备A：将大鼠断头，掀起颅骨，剥去脑膜后取出的脑组织；B：用刀片切去多余部分后的脑组织；C：用冰夹使溶解状态的琼脂凝固从而固定脑组织；D：沿冠状切面切取脑片，切片槽周围放置冰袋降温，切片液中持续通混合气（95％O2和5％CO2）。1.5.3微电极的拉制微电极所用的玻璃管选择美国Sutter公司的硼硅酸盐玻璃管，外径为1.5mm，内径为0.86mm，带芯，有利于充灌电极尖端。在P-97微电极拉制仪上设置相应参数，首先对玻璃、管进行坡度测试，然后在此基础上设置加热值、气体压强、拉制杆移动速度、制冷空气释放的时间长度等。采用三步拉制法，将玻璃管拉成尖端较胖的电极，易于封接。用事先配置好的电极内液充灌时，先在电极靠后的部分注入少许内液，利用虹吸作用使尖端充满，之后再将内液充灌到电极的1/3处，指尖轻弹电极，去除电极尖端残留的气泡，测试电极的阻抗，在5～8MΩ，即为适合实验记录的玻璃微电极。1.5.4脑片膜片钳记录膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个
山西医科大学（博）硕士学位论文92结果2.1刺激电极可诱导大鼠ACC脑区神经元的NMDA电流和AMPA电流将膜电位钳制在+40mV下时，刺激电极可诱导大鼠ACC脑区神经元的外向电流。在灌流液中加入AMPA受体拮抗剂CNQX（20μmol/L）和GABA受体拮抗剂Bicuculline（100μmol/L），可记录到较大的电流；继续加入AP-5（100μmol/L），可见电流被全部抑制，冲洗掉AP-5后电流恢复，证明该电流为NMDA电流，如图2所示。若在灌流液中加入NMDA受体拮抗剂AP-5（100μmol/L）和GABA受体拮抗剂Bicuculline（100μmol/L），可记录到一较小电流；继续加入AMPA受体拮抗剂CNQX（20μmol/L），可见该电流被全部抑制；冲洗掉CNQX后电流恢复，证明该电流为AMPA电流。如图3所示。图2刺激电极诱导的大鼠ACC脑区NMDA电流A：将膜电位钳制在+40mV，刺激电极诱导的ACC脑区神经元的外向电流；B：膜电位钳制在+40mV，脑片灌流液中添加AMPA受体拮抗剂CNQX和GABA受体拮抗剂Bicuculline后的所钳制细胞的电流变化；C：在B的基础上向脑片灌流液中添加NMDA受体拮抗剂AP-5后所钳制细胞的电流被完全抑制；D：冲洗掉AP-5后电流恢复。
山西医科大学（博）硕士学位论文10图3刺激电极诱导的大鼠ACC脑区AMPA电流A：膜电位钳制在+40mV，刺激电极诱导的ACC脑区神经元的外向电流；B：膜电位钳制在+40mV下，脑片灌流液中添加NMDA受体拮抗剂AP-5和GABA受体拮抗剂Bicuculline后所钳制细胞的电流变化；C：在B的基础上向灌流液中添加AMPA受体拮抗剂CNQX后电流被完全抑制；D：冲洗掉CNQX后电流恢复。2.2CFA组大鼠ACC脑区神经元NMDA电流幅度增加脑片灌流液中加入AMPA受体拮抗剂CNQX（20μmol/L）和GABA受体拮抗剂Bicuculline（100μmol/L），将细胞膜电位钳制在+40mV，可记录到ACC区神经元的NMDA电流。CFA组大鼠与NS组大鼠ACC区神经元NMDA电流的幅度相比明显减小（CFA组372.6±26.72pAvs对照组258.6±40.38pA，P<0.05，n=5），如图4所示。
【参考文献】
相关硕士学位论文 前2条
1 代洁琼;电针激活大鼠前扣带皮层κ-阿片受体缓解痛情绪的研究[D];山西医科大学;2018年
2 贾欣;激活前扣带皮层κ-阿片受体对缓解大鼠痛情绪作用的研究[D];山西医科大学;2018年
本文编号：2877964
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/mpalunwen/2877964.html
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