基于肿瘤标本异种移植模型的胃癌转移相关基因研究

发布时间：2020-11-10 19:55

　　 目的:建立基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型,分析其转移特征,初步筛选胃癌转移相关基因并分析其功能,为胃癌的转移研究提供个体化的临床前动物模型。方法:将临床新鲜的胃癌手术标本移植到BALB/c裸鼠皮下建立胃癌异种移植(Patient-derived xenograft,PDX)模型,动态监测肿瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线,连续传代维持肿瘤生长。进一步将皮下肿瘤组织通过手术原位植入到裸鼠胃部肌层建立胃癌原位异种移植(Patient-derived orthotopic xenograft,PDOX)模型,持续观察小鼠的生命体征。通过近红外荧光活体成像技术检测胃部成瘤及远处器官转移的发生。待小鼠消瘦后,解剖荷瘤鼠,将肺转移灶和肝转移灶分别移植到裸鼠皮下形成实体瘤,监测转移瘤的生长。收集原发瘤和转移瘤组织进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)和STR(Short tandem repeat)分型检测,确认其与患者原发瘤组织形态和遗传的一致性。PCR Array初步分析原发瘤和转移瘤中胃癌转移相关基因的表达。RT-PCR和Western Blot检测胃癌传代细胞系中转移相关基因的表达。依据分析结果,选择MMP2基因进一步研究,通过siRNA转染技术沉默MMP2表达,评价MMP2基因对胃癌细胞迁移能力的影响。结果:成功建立了人胃癌PDX移植模型,确认了移植瘤与患者肿瘤组织病理学特征的一致性,通过胃部原位移植发现编号C19751、C65175和B97493的小鼠发生肺和肝的转移。其中肺转移灶经皮下移植后形成了实体瘤,STR分析显示肺转移瘤保持了与原发瘤相似的遗传特征。PCR Array和RT-PCR结果显示,与原发瘤相比,MMP2基因在C19751和B97493转移瘤样本中表达均显著上调。RT-PCR和Western Blot结果显示,与正常胃上皮细胞GES-1相比,胃癌细胞C61262和MKN1中MMP2 mRNA和蛋白表达显著升高,SGC-7901和BGC-823细胞中EPHB2和FXYD5 mRNA表达显著升高。沉默胃癌细胞MKN1和C61262中的MMP2基因后,显著降低了细胞的迁移能力。结论:利用胃癌临床手术标本成功构建了3例胃癌转移模型,均保持了原发肿瘤的生物学特征,为胃癌的转移研究提供了良好的个体化实验模型。进一步筛选出胃癌转移相关基因MMP2及备选基因FXYD5和EPHB2,当沉默MMP2基因时可显著降低胃癌细胞的迁移能力。
【学位单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R735.2
【部分图文】：

基于肿瘤标本异种移植模型的胃癌转移相关基因研究-13-例胃癌转移模型（编号为：C19751、C65175和B97493）。首代胃癌转移模型的建立时间大约在2~4个月，并且可在裸鼠皮下稳定传代扩增维持肿瘤生长，总体建模成功率约为20%。根据胃癌PDX模型肿瘤生长情况，动态监测肿瘤体积，绘制出编号为C19751的移植瘤生长曲线，记为C19751-Con。将肺和肝转移灶移植到裸鼠背部皮下，结果只有肺转移灶形成明显的实体瘤，同时绘制出肺转移瘤皮下移植生长曲线，记为C19751-Met，结果见图2-1。生长曲线显示，肿瘤呈指数生长趋势，符合肿瘤生长特点。转移瘤与原发瘤比，增殖特性无显著性差异。将3例配对标本的肿瘤组织进行H&E染色后，光学显微镜下观察，结果如图2-2。肿瘤组织腺体丰富，呈浸润性生长，肿瘤细胞异型性明显，且处于增值旺盛阶段，符合胃腺癌的病理学特征。小鼠皮下移植瘤、小鼠肺转移瘤和原始患者肿瘤基本保持相似的组织病理结构。图2-1胃癌PDX模型生长曲线Fig.2-1GrowthcurvesofgastriccancerPDXmodel注：C19751（原发瘤/转移瘤）生长曲线（Con为原发瘤，Met为肺转移瘤）Note:GrowthcurvesoftheC19751gastriccancer(Conrepresentsprimarytumor,Metrepresentsmetastatictumor)

第二章移植临床肿瘤标本建立胃癌转移模型-14-图2-2胃癌PDX模型的组织学特征（H&E染色，×400）Fig.2-2HistologiccharacteristicsofgastriccancerPDXmodels(H&Estaining,×400)注：A.原始患者组织；B.小鼠皮下移植瘤；C.小鼠肺转移瘤。Note:A.Primarypatienttumor;B.Mousexenografttumor;C.Mouselungmetastasistumor.2.3.2肿瘤组织溯源性STR分型检测按照试剂盒提供的方法，提取三种胃癌PDX模型（C19715、C65175、B97493）原发瘤及其转移模型肿瘤组织的DNA，进行STR分型检测，结果显示原发瘤和肺转移瘤同源性为99.99%（图2-3），证明异种移植瘤来源于原始患者肿瘤。

基于肿瘤标本异种移植模型的胃癌转移相关基因研究-15-图2-3胃癌PDX模型STR检测Fig.2-3STRdetectionofgastriccancerPDXmodels注：A.C19751原发瘤/转移瘤；B.C65175原发瘤/转移瘤；C.B97493原发瘤/转移瘤。Note:A.C19751primarytumor/metastatictumor;B.C65175primarytumor/metastatictumor;C.B97493primarytumor/metastatictumor.2.3.3胃癌转移模型的特征裸鼠原位移植肿瘤组织4周后，部分小鼠明显消瘦，注射肿瘤靶向性近红外荧光染料MHI-148，通过近红外荧光活体成像发现，荧光信号特异性聚集在肿瘤部位；并在小鼠肺部和肝脏出现明显的荧光信号（图2-4A）。小鼠安乐死后，将其解剖，肉眼可见部分小鼠的肺部出现明显的结节状肿瘤转移灶、部分小鼠的肝脏有多个明显的灰白色粟粒样肿瘤病灶，如图2-4B。取部分转移灶H&E染色后，光学显微镜下观察到肺部和肝脏组织中有明显的肿瘤细胞浸润，部分区域细胞核大，深染，异型性大，可见病理性核分裂像（图2-5）。将肺转移瘤进一步移植到裸鼠背部皮下，大
【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 Chisato Hamashima;;Current issues and future perspectives of gastric cancer screening[J];World Journal of Gastroenterology;2014年38期

2 ;CXCR4/SDF-1 axis is involved in lymph node metastasis of gastric carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2011年19期

3 ;Changes of histology and expression of MMP-2 and nm23-H1 in primary and metastatic gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2008年10期

4 ;Relationship between matrix metalloproteinase-2 mRNA expression and clinicopathological and urokinase-type plasminogen activator system parameters and prognosis in human gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2005年21期

相关硕士学位论文 前1条

1 高云姝;EphB2与胃癌侵袭转移的相关性研究[D];第二军医大学;2009年

本文编号：2878289