LIPUS诱导的hDFSCs外泌体对hDFSCs增殖分化的作用机制研究

发布时间：2020-11-15 15:29

　　 目的:本文旨在通过细胞分子生物学技术研究人牙囊干细胞(human dental follicle stem cells,hDFSCs)外泌体对hDFSCs增殖分化的作用,低强度脉冲超声(Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)作为诱导因素对外泌体特性的影响及可能的调控机制。方法:1.收集10-14岁患者多生埋伏牙的牙囊组织,组织块联合酶消化法提取hDFSCs原代细胞,使用倒置显微镜观察细胞的生长状态及形态,茜素红和油红O染色鉴定其成骨和成脂分化能力,流式细胞术鉴定表面抗原。2.LIPUS辐照处理hDFSCs为实验组,未做LIPUS处理的hDFSCs为对照组。超速离心法提取两种处理条件下hDFSCs分泌的外泌体(con-Exo和LIPUS-Exo);通过蛋白质印迹法鉴定外泌体表面标记蛋白;透射电镜观察外泌体形态特征;纳米颗粒跟踪分析技术分析外泌体粒子浓度和直径分布;PKH26对两种外泌体进行体外荧光标记,与hDFSCs进行共培养,激光共聚焦显微镜观察外泌体能否被内吞。3.功能学实验分为3个组:(1)control;(2)con-Exo;(3)LIPUS-Exo。CCK8试验检测con-Exo和LIPUS-Exo对hDFSCs增殖活性的影响。成骨诱导7天后,分别对3个组的hDFSCs进行碱性磷酸酶(ALP)染色,并检测其碱性磷酸酶(ALP)活性,通过PT-PCR检测ALP、Runx2、Col-1基因的表达;成骨诱导21天后,分别对3个组hDFSCs形成的钙结节进行茜素红染色。4.作用机制研究:成骨分化实验分为6个组:(1)control-0μM GW4869;(2)control-10μM GW4869;(3)control-20μM GW4869;(4)LIPUS-0μM GW4869;(5)LIPUS-10μM GW4869;(6)LIPUS-20μM GW4869。用不同浓度(0μM,10μM,20μM)中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869处理hDFSCs,第4-6组每天LIPUS辐照处理细胞,1-3组作为对照。成骨诱导7天后,通过ALP染色和RT-PCR检测hDFSCs成骨分化能力。炎症抑制实验分为5个组:(1)control;(2)LPS;(3)LIPUS;(4)LIPUS+LPS;(5)LIPUS+LPS+GW4869。使用20μM GW4869抑制外泌体分泌,加入LPS刺激炎症因子分泌,LIPUS处理细胞后通过RT-PCR检测炎症因子的表达。促分泌实验分为2个组:(1)GW4869;(2)GW4869+LIPUS。使用20μM GW4869抑制hDFSCs分泌外泌体后,第2组采用LIPUS仪处理细胞30min,第1组作为对照。通过WB检测外泌体分泌相关蛋白的的表达。结果:1.原代及传代后的hDFSCs呈不规则长梭形,可以在诱导培养条件下表现出成脂和成骨分化的能力。流式细胞术结果表明hDFSCs可阳性表达CD90、CD105和CD146,阴性表达CD31和CD45。所以hDFSCs是具备多向分化潜能的间充质来源干细胞。2.超速离心法提取未经LIPUS处理和LIPUS处理后hDFSCs分泌的外泌体(con-Exo和LIPUS-Exo),蛋白质印迹法证实外泌体表面标记蛋白CD9、CD63、TSG101为阳性,Calnexin为阴性;LIPUS-Exo蛋白表达量高于con-Exo;透射电镜下观察到两种外泌体呈双层膜碟状结构;纳米颗粒跟踪分析技术结果发现con-Exo和LIPUS-Exo平均粒径符合外泌体粒径范围,相同细胞量提取的外泌体中LIPUS-Exo浓度大于con-Exo浓度;激光共聚焦显微镜下观察到经PKH26荧光标记的外泌体在与hDFSCs共培养以后,可以经细胞膜内吞进入细胞,并分布于细胞质。3.CCK8试验证明,con-Exo和LIPUS-Exo处理均可使hDFSCs增殖活性增强。成骨诱导7天后,外泌体处理组的ALP染色明显深于对照组。同时,外泌体处理可显著增强hDFSCs的ALP活性,并促进成骨相关基因ALP、Runx2、Col-1的表达。成骨诱导21天后,外泌体处理组的钙结节形成能力明显强于对照组。LIPUS-Exo促进hDFSCs增殖和成骨分化的作用强于con-Exo。4.在成骨诱导培养的条件下使用不同浓度(0μM,10μM,20μM)的GW4869处理hDFSCs,7天后进行ALP染色,细胞染色深度呈浓度依赖性降低;成骨诱导期间进行了LIPUS辐照处理的hDFSCs染色深度强于未作LIPUS处理的细胞。RT-PCR检测结果显示,在成骨诱导培养的条件下,使用不同浓度的GW4869处理细胞后,成骨相关基因表达量呈浓度依赖性降低;LIPUS处理可使相应组成骨相关基因表达量升高。LPS刺激引起了hDFSCs炎症因子IL-8的表达;使用GW4869抑制hDFSCs外泌体分泌后,IL-8表达量进一步升高;增加诱导因素LIPUS可使hDFSCs的IL-8表达量降低。WB结果显示,经GW4869处理后,hDFSCs外泌体分泌相关蛋白表达量较低,而进行LIPUS辐照处理后,外泌体分泌相关蛋白表达量升高。结论:本实验证明LIPUS诱导的hDFSCs来源外泌体可以通过内吞作用进入hDFSCs内,促进hDFSCs的增殖和成骨分化。实验结果显示LIPUS对hDFSCs成骨分化的促进作用可能部分归因于其增加了hDFSCs外泌体分泌相关蛋白的表达来促进hDFSCs外泌体分泌,以及抑制了炎症反应。hDFSCs来源广泛,具有牙周组织分化潜能,且hDFSCs外泌体容易储存和移植,具有较低的免疫原性,可以为牙周再生提供新思路。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R781.05
【部分图文】：

1hDFSCs的原代和传代培养（40×）

重庆医科大学硕士研究生学位论文18Figure1-2.1TheprimarycultureandsubcultureofhDFSCs（40×）A:原代hDFSCs从组织周围开始成长，逐渐长满整个培养瓶B:第3代hDFSCs，细胞呈长梭形结构2.2人牙囊干细胞（hDFSCs）多向分化能力鉴定在成骨诱导21天后，hDFSCs呈紧密、多层重叠的立体结构，并且肉眼可见矿化结节。茜素红染色后，镜下观察可见细胞间有红色的矿化结节（图1-2.2A）。在成脂诱导23天后，hDFSCs形态变为多角形，镜下可见白色脂滴。油红O染色后，镜下观察可见橙红色脂滴（图1-2.2B）。图1-2.2hDFSCs的多向分化能鉴定（40×）Figure1-2.2ThedetectionofmultipotentialdifferentiationabilityofhDFSCs（40×）A:成骨诱导后茜素红染可见红钙结节B:成脂诱导后油红O染可见橘红脂滴2.3人牙囊干细胞（hDFSCs）分子表型鉴定流式细胞术检测结果显示hDFSCs分子表型为：间充质干细胞特异性表面抗原表达：CD90：99.59%（图1-2.3C）；CD105：76.56%（图1-2.3D）；CD146：59.50%（图1-2.3E）；造血系细胞表面抗原表达：CD31：0.33%（图1-2.3A）；CD45：0.70%（图1-2.3B）。此结果表明，hDFSCs为间充质来源，且有干细胞特性。

重庆医科大学硕士研究生学位论文19图1-2.3hDFSCs的分表型的流式细胞术鉴定Figure1-2.3ThemolecularphenotypeidentificationofhDFSCsbyflowcytometryA:CD31分表型B:CD45分表型C:CD90分表型D:CD105分表型E:CD146分表型3讨论牙囊是与牙齿萌出和发育相关的、围绕在牙胚周围的疏松结缔组织。有学者研究发现，围绕在下颌前磨牙牙胚的牙囊在牙齿的萌出过程中起关键作用，如果没有牙囊的存在，牙齿就无法萌出[37]。已有研究成功分离出人牙囊细胞，且该细胞呈纺锤形结构，旋涡状排列，细胞质清亮，可贴壁生长，具有成纤维细胞特性[38]。hDFSCs具有较高的增殖能力，热压环境可以增强其增殖能力[39]。此外,hDFSCs具有干细胞特性，在一定条件下可以向成骨、成脂和软骨细胞分化[40]。与骨髓间充质干细胞相比，hDFSCs的CD146表达量较高。CD146是间充质干细胞早期标志物，因此hDFSCs具有较强的克隆形成能力和多向分化能力[41]。牙囊细胞常作为种子细胞或辅助其他种子细胞进行牙周再生。有学者利用细胞膜片技术延长了细胞的存活时间，使其在相对长的时间内持续释放生长因子和细胞因子，进而促进牙周再生[34]。也有研究者将牙囊细胞与健康成人和牙周炎患者的牙周膜干细胞（hPDLSCs）共培养，发现牙囊细胞可使两种hPDLSCs的多向分化能力及自我更新能力增强[42]。
【参考文献】

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本文编号：2884918