NLRC3通过抑制TRAF6-K63泛素化减轻RAW264.7细胞缺氧复氧炎性反应的作用机制研究

发布时间：2020-11-16 06:11

　　 目的:探讨NLR家族含CARD结构蛋白3(NLR family CARD-containing 3,NLRC3)对肝缺血再灌注体外模型RAW264.7细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)炎性反应的影响,明确NLRC3减轻RAW264.7细胞H/R炎性反应的具体分子机制。方法:建立小鼠肝脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型,采用Western blot技术检测肝组织NLRC3蛋白表达以及ELISA技术检测血清IL-1β水平;建立RAW264.7细胞H/R体外模型,Western blot法检测RAW264.7细胞中NLRC3、TRAF6及其K63泛素化、NF-κB p65亚基、磷酸化p65(p-p65)、IκBα的蛋白水平;采用Co-IP技术检测RAW264.7细胞内NLRC3和TRAF6蛋白的生理性相互结合;运用细胞免疫荧光技术检测RAW264.7细胞中NF-κB p65亚基入核水平;采用ELISA技术检测细胞培养液中IL-1β的含量。结果:在小鼠肝脏I/R模型中,随再灌注时间延长,血清IL-1β含量增高(P0.05),NLRC3蛋白在肝组织中的表达降低(P0.05);在RAW264.7细胞H/R体外模型中,NLRC3、IκBα蛋白表达随复氧时间增加而降低,而p-p65/p65、TRAF6蛋白及其K63泛素化水平则与之相反(P0.05);Co-IP结果表明NLRC3与TRAF6之间存在生理性相互结合;过表达NLRC3对TRAF6蛋白的组成性表达无显著影响(P0.05),但能明显降低H/R细胞模型中TRAF6-K63泛素化、p-p65/p65蛋白水平,上调IκBα表达(P0.05);过表达NLRC3显著抑制NF-κB p65亚基激活核转运水平(P0.05),细胞培养液中IL-1β的含量也明显降低(P0.05)。结论:在小鼠肝脏I/R和RAW264.7细胞H/R模型中,NLRC3的蛋白表达随再灌注/复氧时间延长而降低。过表达NLRC3对H/R炎症模型中促炎因子的释放产生显著抑制作用,其可能机制为通过降低TRAF6-K63泛素化水平抑制NF-κB信号通路活化从而减轻细胞炎症反应。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R657.3
【部分图文】：

重庆医科大学硕士研究生学位论文21图1小鼠肝脏I/R处理后不同再灌注时间点血清IL-1β和肝组织NLRC3的表达变化Fig1TheconcentrationofIL-1βinmiceserumandexpressionofNLRC3inmicelivertissuesatdifferentreperfusiontimepointafterliverI/RtreatmentA：小鼠肝I/R模型中血清IL-1β含量；B：肝组织NLRC3蛋白水平；C:半定量分析肝组织NLRC3的蛋白表达。aP＜0.05vs假手术组。A：IL-1βserumlevelinmiceafterI/Rstimuli;B:TheNLRC3proteinlevelinliversfrommicesubjectedtoshamtreatmentorischemiafor1hfollowedbyreperfusionfortheindicatedtime;C:Semi-quantitativeanalysisofNLRC3proteinlevelineachgroup.aP＜0.05vsSham.2.2H/R处理后，细胞内NLRC3和NF-κB的表达改变结合本课题组前期实验结果[20]，在该项研究中我们构建了缺氧12h，复氧时间梯度为R0h、R1h、R2h、R3h、R6h、R9h的RAW264.7细胞H/R炎症模型。Westernblot结果示，与R0h组相比，细胞内NLRC3和IκBα蛋白表达随复氧时间延长而下降，而p-p65/p65比值随复氧时间延长而增高（aP＜0.05）。结果表明，在RAW264.7细胞H/R模型复氧早期，NF-κB信号活化水平增高的同时NLRC3蛋白表达呈降低趋势（图2）。

重庆医科大学硕士研究生学位论文22图2H/R处理后，不同复氧时间点RAW264.7细胞中NLRC3与NF-κB的蛋白表达改变Fig2TheproteinexpressionlevelsofNLRC3andNF-κBsignalinginRAW264.7cellsafterH/RtreatmentofindicatedreoxygenationtimepointA:NLRC3、p-p65、p65、IκBα的蛋白表达;B-D:NLRC3、p-p65/p65、IκBα蛋白水平的半定量分析。aP＜0.05vsR0h组。A:TheproteinlevelsofNLRC3、p-p65、p65andIκBα;B-D:Semi-quantitativeanalysisofNLRC3、p-p65/p65、IκBαproteinlevelineachgrouprespectively.aP＜0.05vsR0h.2.3H/R处理后，细胞内TRAF6及其K63泛素化水平的表达改变采用免疫沉淀联合印迹技术检测经缺氧12h，复氧0h、1h、2h、3h、6h、9h后的各组细胞内TRAF6蛋白及其K63泛素化水平。结果显示，与R0h组相比较，随复氧时间增加，除外R1h升高程度组间差异不显著，其余各组TRAF6蛋白表达及其K63泛素化水平均显著增高（aP＜0.05）。结合2.2实验结果，我们初步分析在RAW264.7细胞H/R模型中，NLRC3和TRAF6的蛋白表达可能呈负向变化趋势。在此，我们选择缺氧12h继而复氧9h作为后续实验中细胞H/R模型的标本获取和检测时间点（图3）。

重庆医科大学硕士研究生学位论文23图3H/R处理后，不同复氧时间点RAW264.7细胞中TRAF6及其K63泛素化水平的蛋白表达改变Fig3ImmunoblotanalysisoftheTRAF6anditsK63-linkedubiquitinationexpressioninRAW264.7cellsafterH/RtreatmentofindicatedreoxygenationtimepointA:RAW264.7细胞内TRAF6及其K63泛素蛋白表达；B:TRAF6蛋白半定量结果；C:TRAF6-K63泛素蛋白半定量结果。aP＜0.05vsR0h组。A:IPcombiningimmunoblottinganalysesofTRAF6anditsK63ubiquitinproteinlevels;B:RelativeexpressionlevelofTRAF6;C:RelativeexpressionlevelofTRAF6-K63ubiquitinprotein.aP＜0.05vsR0h.2.4NLRC3与TRAF6的生理性相互结合采用Co-IP实验技术对RAW264.7细胞处于生理稳态时NLRC3与TRAF6分子的相互结合情况进行检测。实验结果表明，用TRAF6抗体沉淀的蛋白提取物上样电泳，转膜后孵育NLRC3抗体，曝光显影能检测到NLRC3蛋白，且用NLRC3抗体沉淀的蛋白提取物中也能检测到TRAF6蛋白，同时，IgG阴性对照组均未检测到TRAF6和NLRC3蛋白表达，Lysate阳性对照组中可检测到二者的蛋白表达
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本文编号：2885716