渐进性梯度孔径支架联合BMP2-ADSCs及自体PRP凝胶修复骨软骨缺损的实验研究
发布时间：2020-12-07 22:51
目的:在已成功制备梯度孔径SF-CS-n HA骨软骨支架的基础上,通过复合BMP2-ADSCs和自体PRP凝胶构建骨软骨移植体修复比格犬膝关节骨软骨缺损,完成移植体总体性能的检测,以期为修复骨软骨缺损提供一种更加合适的骨软骨移植体。方法:采用Ⅰ型胶原酶消化的方法提取比格犬ADSCs,培养至第3代,通过CCK-8法检测ADSCs增殖活性,通过免疫荧光和流式细胞术鉴定ADSCs表面抗原的表型。探索LV-BMP2-GDF转染ADSCs的最佳MOI值,对BMP2-ADSCs进行传代培养后通过RT-PCR检测种子细胞中BMP-2基因水平。对比格犬静脉血通过离心的方法制备PRP,利用牛凝血酶激活PRP为凝胶状态,利用ELISA检测PRP凝胶中TGF-β1和PDGF-BB释放水平。利用梯度孔径SF-CS-n HA骨软骨支架、BMP2-ADSCs、自体PRP凝胶构建骨软骨移植体,将移植体植入比格犬膝关节股骨远端滑车中央骨软骨缺损处。将24只比格犬随机分为A组（细胞-PRP-支架组）、B组（PRP-支架组）、C组（单纯支架组）和D组（空白对照组）,A组:BMP2-ADSCs+PRP凝胶+支架;B组:PR...
【文章来源】：遵义医科大学贵州省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
%浓度SF-CS-nHA梯度孔径支架及支架扫描电镜
遵义医科大学硕士学位论文熊坤17图2比格犬膝关节全层骨软骨缺损（直径：4mm，深度：5mm）及移植体植入后状态Fig.2Beagledogfullthicknessosteochondraldefect(diameter:4mm,depth:5mm)andpost-implantationstate1.2.5术后各项指标检测（1）大体观察注射盐酸氯胺酮处死各组术后2月、4月比格犬。沿先前手术切口逐层剖开膝关节，暴露骨软骨缺损模型处。观察关节腔内是否存在感染、组织粘连。观察骨软骨缺损处的修复情况，如质地、颜色以及与周围正常软骨组织的整合情况。截取骨软骨缺损修复模型及周围正常骨软骨，4%多聚甲醛固定1-2d，加入适量EDTA脱钙液对样本进行脱钙，每3天更换一次脱钙溶液，脱钙两周左右样本变软。（2）影像学观察骨质再生在遵义医科大学第三附属医院（遵义市第一人民医院）影像科对A组（细胞-PRP-支架组）进行术前、术后、术后2月、术后4月进行X射线拍照，分析骨软骨缺损处骨质的修复效果。（3）移植体中BMP2-ADSCs存活情况对2个月的实验组比格犬行1％戊巴比妥钠（1mL/kg）经腹腔注射麻醉后，取仰卧位固定，备皮、碘伏消毒和铺巾。沿先前的手术切口膝关节外侧手术切口，逐层剖开组织至关节腔，找到骨软骨缺损修复处，用5mm环钻将骨软骨缺损修复处的骨软骨取出，缝合比格犬膝关节切口。将取出后的样本进行涂片后迅速转移至暗室中，用
遵义医科大学硕士学位论文熊坤202结果2.1ADSCs的提娶培养、鉴定和增殖结果2.1.1ADSCs的提取和培养比格犬脂肪组织剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化30min，可见脂肪组织几乎被消化成糊状时既消化完成，见图3。加入完全培养基终止消化，无菌纱网过滤，离心，培养基重悬后种入细胞培养瓶培养。1d后可见培养瓶底部有单个的细胞和细胞团贴壁，培养液中有较多的脂肪亮点。培养3d后，贴壁细胞较第1d增多，细胞团周围细胞分裂活跃，单个细胞多呈梭形、纺锤形或三角形。培养6天后，细胞基本铺满瓶底面积80%以上，细胞形态基本一致。传代至第2代和第3代时，细胞呈漩涡状样或鱼群样生长，生长活跃，细胞形态均一，梭形和纺锤形明显，见图4。图3脂肪粒用0.1%Ⅰ型胶原酶消化30min后的状态Fig.3Thestateoffatgranulesafterdigestionwith0.1%collagenasetypeIfor30minutes
【参考文献】：
期刊论文
[1]人胎盘间充质干细胞的扩增与鉴定[J]. 马晨,李晓国,徐明均,马晓娜,马晓薇. 中国组织工程研究. 2019(33)
[2]丝素蛋白壳聚糖和纳米羟基磷灰石制备骨软骨梯度孔径支架初探[J]. 肖红利,黄文良,熊坤,李茂伦,陈禺,邓江. 中华老年医学杂志. 2018 (07)
[3]基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比[J]. 李诗鹏,李强,石正松,蔡伟良,宁寅宽,陶旋. 中国组织工程研究. 2017(09)
[4]富血小板血浆制备方法稳定性的研究[J]. 潘红娟,王雅丽,吕爽,刘铁梅. 中国实验诊断学. 2016(06)
[5]丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价[J]. 马立坤,叶鹏,邓江,黄文良,田仁元,吕雪峰. 西部医学. 2014(08)
[6]腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察[J]. 陈佳滨,李强,茹嘉,武成聪,宁寅宽,蔡伟良. 中国骨质疏松杂志. 2014(08)
[7]兔富血小板血浆制备及其活性分析[J]. 王鹏飞,时长江,王玉亮,姜文学. 中国组织工程研究. 2013(08)
[8]富血小板血浆临床应用及其生物材料性能[J]. 李明,张长青. 中国组织工程研究与临床康复. 2011(08)
[9]BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性[J]. 张银刚,郭雄,师常宏,邹爱民,许鹏. 中南大学学报(医学版). 2005(01)
硕士论文
[1]渐进性梯度孔径骨软骨支架的制备及性能研究[D]. 肖红利.遵义医科大学 2019
[2]自体与异体脂肪间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的比较研究[D]. 汪兆艳.军事科学院 2018
本文编号：2904020
【文章来源】：遵义医科大学贵州省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
%浓度SF-CS-nHA梯度孔径支架及支架扫描电镜
遵义医科大学硕士学位论文熊坤17图2比格犬膝关节全层骨软骨缺损（直径：4mm，深度：5mm）及移植体植入后状态Fig.2Beagledogfullthicknessosteochondraldefect(diameter:4mm,depth:5mm)andpost-implantationstate1.2.5术后各项指标检测（1）大体观察注射盐酸氯胺酮处死各组术后2月、4月比格犬。沿先前手术切口逐层剖开膝关节，暴露骨软骨缺损模型处。观察关节腔内是否存在感染、组织粘连。观察骨软骨缺损处的修复情况，如质地、颜色以及与周围正常软骨组织的整合情况。截取骨软骨缺损修复模型及周围正常骨软骨，4%多聚甲醛固定1-2d，加入适量EDTA脱钙液对样本进行脱钙，每3天更换一次脱钙溶液，脱钙两周左右样本变软。（2）影像学观察骨质再生在遵义医科大学第三附属医院（遵义市第一人民医院）影像科对A组（细胞-PRP-支架组）进行术前、术后、术后2月、术后4月进行X射线拍照，分析骨软骨缺损处骨质的修复效果。（3）移植体中BMP2-ADSCs存活情况对2个月的实验组比格犬行1％戊巴比妥钠（1mL/kg）经腹腔注射麻醉后，取仰卧位固定，备皮、碘伏消毒和铺巾。沿先前的手术切口膝关节外侧手术切口，逐层剖开组织至关节腔，找到骨软骨缺损修复处，用5mm环钻将骨软骨缺损修复处的骨软骨取出，缝合比格犬膝关节切口。将取出后的样本进行涂片后迅速转移至暗室中，用
遵义医科大学硕士学位论文熊坤202结果2.1ADSCs的提娶培养、鉴定和增殖结果2.1.1ADSCs的提取和培养比格犬脂肪组织剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化30min，可见脂肪组织几乎被消化成糊状时既消化完成，见图3。加入完全培养基终止消化，无菌纱网过滤，离心，培养基重悬后种入细胞培养瓶培养。1d后可见培养瓶底部有单个的细胞和细胞团贴壁，培养液中有较多的脂肪亮点。培养3d后，贴壁细胞较第1d增多，细胞团周围细胞分裂活跃，单个细胞多呈梭形、纺锤形或三角形。培养6天后，细胞基本铺满瓶底面积80%以上，细胞形态基本一致。传代至第2代和第3代时，细胞呈漩涡状样或鱼群样生长，生长活跃，细胞形态均一，梭形和纺锤形明显，见图4。图3脂肪粒用0.1%Ⅰ型胶原酶消化30min后的状态Fig.3Thestateoffatgranulesafterdigestionwith0.1%collagenasetypeIfor30minutes
【参考文献】：
期刊论文
[1]人胎盘间充质干细胞的扩增与鉴定[J]. 马晨,李晓国,徐明均,马晓娜,马晓薇. 中国组织工程研究. 2019(33)
[2]丝素蛋白壳聚糖和纳米羟基磷灰石制备骨软骨梯度孔径支架初探[J]. 肖红利,黄文良,熊坤,李茂伦,陈禺,邓江. 中华老年医学杂志. 2018 (07)
[3]基因重组腺病毒载体与慢病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的对比[J]. 李诗鹏,李强,石正松,蔡伟良,宁寅宽,陶旋. 中国组织工程研究. 2017(09)
[4]富血小板血浆制备方法稳定性的研究[J]. 潘红娟,王雅丽,吕爽,刘铁梅. 中国实验诊断学. 2016(06)
[5]丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石骨组织工程支架材料的体外细胞毒性评价[J]. 马立坤,叶鹏,邓江,黄文良,田仁元,吕雪峰. 西部医学. 2014(08)
[6]腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察[J]. 陈佳滨,李强,茹嘉,武成聪,宁寅宽,蔡伟良. 中国骨质疏松杂志. 2014(08)
[7]兔富血小板血浆制备及其活性分析[J]. 王鹏飞,时长江,王玉亮,姜文学. 中国组织工程研究. 2013(08)
[8]富血小板血浆临床应用及其生物材料性能[J]. 李明,张长青. 中国组织工程研究与临床康复. 2011(08)
[9]BMP2-EGFP融合蛋白的构建及其生物活性[J]. 张银刚,郭雄,师常宏,邹爱民,许鹏. 中南大学学报(医学版). 2005(01)
硕士论文
[1]渐进性梯度孔径骨软骨支架的制备及性能研究[D]. 肖红利.遵义医科大学 2019
[2]自体与异体脂肪间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的比较研究[D]. 汪兆艳.军事科学院 2018
本文编号：2904020
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