肌脂蛋白介导的细胞转分化在衰老骨骼肌纤维化中的作用
发布时间：2021-03-21 04:57
目的:探究肌脂蛋白（Sarcolipin,SLN）在衰老骨骼肌纤维化中的作用。方法:不同浓度（0,10,20,40g/L）的D-半乳糖（D-gal）诱导C2C12成肌细胞衰老,CCK-8检测其增殖活性,流式细胞术检测其凋亡状况;衰老相关β-半乳糖苷酶试剂盒对衰老细胞染色;Western Blot检测衰老相关蛋白P16和P53的表达。Western blot检测纤维化相关指标TGF-β1,及胶原蛋白的主要成分Col1和Col3的蛋白表达;qPCR检测上述三个指标的mRNA水平的表达。免疫荧光与qPCR检测衰老肌细胞SLN的表达,流式细胞术和荧光探针法检测细胞内钙离子浓度的变化。细胞内转入含SLN基因（Ad-SLN）的重组腺病毒以敲低SLN的表达,转入含绿色荧光蛋白基因（Ad-GFP）的重组腺病毒转作为阴性对照,qPCR和Western blot检测TGF-β1,转分化相关指标α-SMA及Col1与Col3的mRNA及蛋白表达。结果:D-gal成功诱导C2C12成肌细胞衰老:CCK8与流式细胞术检测结果表明D-gal浓度在20g/L时细胞增殖活性下降明显,晚期凋亡细胞数最多,且总细胞存活数...
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
半乳糖诱导
重庆医科大学硕士研究生学位论文16apoptosisforeachgroupwasdetectedbyflowcytometry.Datawereanalyzedusingaone-wayANOVA.*P<0.01vs.controlgroup,(n=3.mean±SD).(E)Senescence-relatedproteinp53andp16expressionlevelsweremeasuredbywesternblotting.GAPDHwasusedastheloadingcontrol.Valuesforthecontrolgroupwerearbitrarilysettoaunitof1.Datawereanalyzedusingaone-wayANOVA.*P<0.05vs.controlgroup,n=3.2.2衰老C2C12细胞胶原蛋白表达的变化TGF-β1是经典的促纤维化细胞因子之一，参与组织细胞纤维化的发生[19]。为了确定D-gal诱导的肌细胞衰老是否伴随纤维化改变，我们测定了TGF-β1，以及ECM的主要成分I型和III型胶原蛋白的表达情况。如图2A所示，D-gal诱导细胞衰老后，TGF-β1和III型胶原蛋白的表达显着增加（P＜0.05），但Ⅰ型胶原蛋白的表达没有明显增加。与WesternBlot结果一致，在D-gal组中，TGF-β1和III型胶原的mRNA表达显着增加（P<0.05；图2B）。我们的数据表明，D-gal诱导的C2C12细胞衰老伴随细胞胶原蛋白基因及蛋白表达的增加，提示有纤维化改变的发生。图2D半乳糖对C2C12细胞胶原蛋白表达的影响Fig.2EffectofD-galoncollagenexpressioninC2C12cells.（A）通过WesternBlot分析确定TGF-β1，col1和col3的蛋白质水平。TGF-β1，col1和col3
重庆医科大学硕士研究生学位论文18图3D半乳糖诱导的细胞衰老对SLN的影响Fig.3EffectofD-gal-inducedC2C12cellonSLN.（A）通过RT-qPCR检测到的SLN和SERCA2amRNA表达。*与对照组相比，P<0.05，**P<0.01，与对照组相比（n=3。平均值±SD）。（B）对照组和衰老组的SLN免疫荧光染色。比例尺，20μm。*与对照组相比，P<0.05（n=3。平均值±SD）。（C）WesternBlot分析确定的SERCA2a蛋白表达。GAPDH作为对照。*与对照组相比，P<0.05（n=3。平均值±SD）。（D）在对照和衰老组细胞中，使用BBCellProbeF03对钙进行免疫荧光染色30分钟（×200倍）。（E）通过流式细胞仪定量分析细胞内钙离子数量。对照组（A，B，C）的值设置为1。使用T检验分析数据（A，B，C）。(A)SLNandSERCA2amRNAexpressionlevelsasdetectedbyRT-qPCR.*Comparedwiththecontrolgroup,P<0.05,**P<0.01vscontrolgroup,(n=3.mean±SD).(B)TheimmunofluorescentstainingforSLNoncontrolandD-galdishes.Scalebar,20μm.*Comparedwiththecontrolgroup,P<0.05(n=3.mean±SD).(C)SERCA2aproteinlevelsasdeterminedbywesternblotanalysis.GAPDHwasusedastheloadingcontrol.*Comparedwiththecontrolgroup,P
【参考文献】：
期刊论文
[1]衰老和运动诱导细胞外基质变化对骨骼肌重塑的研究进展[J]. 金晶,冯祎中,杨洲,冯燕,陈彩珍,卢健. 浙江体育科学. 2017(06)
本文编号：3092368
【文章来源】：重庆医科大学重庆市
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
半乳糖诱导
重庆医科大学硕士研究生学位论文16apoptosisforeachgroupwasdetectedbyflowcytometry.Datawereanalyzedusingaone-wayANOVA.*P<0.01vs.controlgroup,(n=3.mean±SD).(E)Senescence-relatedproteinp53andp16expressionlevelsweremeasuredbywesternblotting.GAPDHwasusedastheloadingcontrol.Valuesforthecontrolgroupwerearbitrarilysettoaunitof1.Datawereanalyzedusingaone-wayANOVA.*P<0.05vs.controlgroup,n=3.2.2衰老C2C12细胞胶原蛋白表达的变化TGF-β1是经典的促纤维化细胞因子之一，参与组织细胞纤维化的发生[19]。为了确定D-gal诱导的肌细胞衰老是否伴随纤维化改变，我们测定了TGF-β1，以及ECM的主要成分I型和III型胶原蛋白的表达情况。如图2A所示，D-gal诱导细胞衰老后，TGF-β1和III型胶原蛋白的表达显着增加（P＜0.05），但Ⅰ型胶原蛋白的表达没有明显增加。与WesternBlot结果一致，在D-gal组中，TGF-β1和III型胶原的mRNA表达显着增加（P<0.05；图2B）。我们的数据表明，D-gal诱导的C2C12细胞衰老伴随细胞胶原蛋白基因及蛋白表达的增加，提示有纤维化改变的发生。图2D半乳糖对C2C12细胞胶原蛋白表达的影响Fig.2EffectofD-galoncollagenexpressioninC2C12cells.（A）通过WesternBlot分析确定TGF-β1，col1和col3的蛋白质水平。TGF-β1，col1和col3
重庆医科大学硕士研究生学位论文18图3D半乳糖诱导的细胞衰老对SLN的影响Fig.3EffectofD-gal-inducedC2C12cellonSLN.（A）通过RT-qPCR检测到的SLN和SERCA2amRNA表达。*与对照组相比，P<0.05，**P<0.01，与对照组相比（n=3。平均值±SD）。（B）对照组和衰老组的SLN免疫荧光染色。比例尺，20μm。*与对照组相比，P<0.05（n=3。平均值±SD）。（C）WesternBlot分析确定的SERCA2a蛋白表达。GAPDH作为对照。*与对照组相比，P<0.05（n=3。平均值±SD）。（D）在对照和衰老组细胞中，使用BBCellProbeF03对钙进行免疫荧光染色30分钟（×200倍）。（E）通过流式细胞仪定量分析细胞内钙离子数量。对照组（A，B，C）的值设置为1。使用T检验分析数据（A，B，C）。(A)SLNandSERCA2amRNAexpressionlevelsasdetectedbyRT-qPCR.*Comparedwiththecontrolgroup,P<0.05,**P<0.01vscontrolgroup,(n=3.mean±SD).(B)TheimmunofluorescentstainingforSLNoncontrolandD-galdishes.Scalebar,20μm.*Comparedwiththecontrolgroup,P<0.05(n=3.mean±SD).(C)SERCA2aproteinlevelsasdeterminedbywesternblotanalysis.GAPDHwasusedastheloadingcontrol.*Comparedwiththecontrolgroup,P
【参考文献】：
期刊论文
[1]衰老和运动诱导细胞外基质变化对骨骼肌重塑的研究进展[J]. 金晶,冯祎中,杨洲,冯燕,陈彩珍,卢健. 浙江体育科学. 2017(06)
本文编号：3092368
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