基于催化发夹组装的双端DNAzyme级联反馈放大策略检测HIV-1 DNA的研究

发布时间：2021-07-25 23:29

　　目的:人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）,作为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）（又称艾滋病）的主要病原体亚型,具有较高的传染性及较强的致病性。实现精准的HIV-1感染检测在AIDS的诊断、治疗、防控中起着至关重要的作用。目前,针对机体产生的特异性免疫抗体的血清学检测是HIV-1感染实验室诊断的主要手段。然而抗体产生前的“窗口期”阻碍了对感染结果的早期判断。另外,针对HIV-1核酸的实时荧光定量PCR（qPCR）检测,虽然不存在“窗口期”的漏检,但是其对人员、设备要求高。为了更好地满足实验室对HIV-1检测方法的需求,本研究提出了一个简单、灵敏的全核酸级联反馈放大策略,对HIV-1相关DNA（HIV-1 DNA）进行了无蛋白酶参与的均相检测,以期为早期HIV-1感染提供新的检测思路。方法:1.反应过程:当目标DNA存在时,通过目标驱动的催化发夹组装（CHA）循环反应,依次打开发夹H₁和H₂,形成双末端具有活性DNAzyme的H₁-H₂杂交双链。其进一步循环剪切含rA切割位点的荧光淬灭发夹底物H

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

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催化发夹组装的双端DNAzyme级联反馈放大用于HIV-1DNA分析的原理图

重庆医科大学硕士研究生学位论文16然后将10μL混合溶液上样至12%非变性聚丙烯酰胺凝胶中。在室温下，上样后的凝胶在1×TBE缓冲液（89mMTris-boricacid，2mMEDTA，pH=8.4）中以100V恒定电压运行50分钟。随后，凝胶在GelRed染液中染色30分钟。最后，用Bio-RadChemDocXRS凝胶成像系统进行显像。2结果与讨论2.1发夹探针的二级结构所有核酸发夹（H1，H2和H3）在设计时都通过了开放在线软件NUPACK（http://www.nupack.org/）的验证，具体的二级结构如图2所示。由于发夹中特定结构域决定了该域中核苷酸的类型，所以长度为2或3个核苷酸的小茎不可避免地出现在发夹结构中。研究报道[46]，探针发夹环内2-3个核苷酸长的小茎不会对分子信标的性能产生不利影响，表明发夹探针中的小茎不会影响主发夹结构。这可能是由于2或3个核苷酸长度的小茎具有较小的负自由能，其无法在室温下稳定存在。因此，本研究使用这些发夹来进行后续实验。图2发夹探针的二级结构图Fig.2Secondarystructurediagramsofhairpinprobes2.2可行性分析为了验证该级联反馈放大方法检测HIV-1DNA的可行性，首先记录了不同混合条件下的荧光发射光谱。如图3（A）所示，当仅有H1或H2被排除在反应系统

重庆医科大学硕士研究生学位论文17之外时，只能获得非常弱的背景荧光信号（曲线a和b）。这一结果表明，在目标触发的CHA过程不能完整进行时，H1和H2末端的两个空间分裂的依赖Mg2+的DNAzyme序列不具有催化活性，其不能剪切分离H3以恢复荧光信号。此外，没有目标DNA参与的反应系统显示出比上述情况稍高但仍较弱的背景荧光强度（曲线c），这表明可能由于发夹茎区末端双螺旋结构的“呼吸”作用而自发生成极少量H1-H2复合物参与后续反应[47]。但是，当添加目标DNA到反应系统后，结果发现荧光强度急剧增加（曲线e），表明CHA-DNAzyme级联反馈放大过程已被成功触发。另外，在不存在Mg2+的情况下，观察到强度较低的荧光信号（曲线d），证明了没有Mg2+作为辅因子，DNAzyme没有催化活性。此外，也暗示了Mg2+的存在能稳固H3的茎环结构，降低其背景荧光强度。为了进一步证实双端DNAzyme双链的形成和依赖Mg2+的DNAzyme剪切作用，随后进行了Native-PAGE。从图3（B）中可以看出，H1和H2混合后几乎没有出现新的明显条带（泳道3），表明H1和H2在没有目标DNA的情况下能相对稳定共存。当目标DNA与H1和H2一起孵育时，在H1上方产生了一条明亮的新条带，其电泳迁移率慢得多(泳道5)，表明通过CHA反应，成功地形成了相应的H1-H2双链。此外，与泳道6中的H3条带相比，泳道8中的H3条带颜色变淡，同时在其下方出现了电泳迁移率更快的新条带，这表明H1-H2双链上的双端DNAzyme能有效地剪切H3。在没有目标DNA参与的情况下，泳道7上没有出现上述明显现象。这些结果均证明了所提出的级联反馈放大方法能够用于检测HIV-1DNA。图3（A）不同混合物的荧光发射光谱;（B）CHA-DNAzyme级联反馈放大过程的Native-PAGE表征


本文编号：3302986