NUP98-HOXA10hd融合蛋白在移植背景下维持谱系特化祖细胞多谱系造血生成研究
发布时间：2021-08-08 16:32
目的:异体造血干细胞移植被广泛用于治疗血液类疾病（如白血病,贫血症等）,用来实现长期的多谱系造血重建。但是,异体来源的造血干细胞细胞来源问题限制了造血干细胞移植的临床应用。脐带血作为异体造血干细胞的细胞来源之一,具有很多优点,例如相对容易获得较低的免疫源性,即使在HLA配型不一致的情况下,也很少发生GVHD现象。但是每份脐带血中所含的HSCs数量少,不足以移植一个个体,这个缺点极大限制了其作为造血干细胞移植的供体细胞。多能造血祖细胞（MPPs）作为造血干细胞的直接衍生细胞,可以分化产生所有谱系的成熟血液细胞。探索延长多能造血祖细胞和谱系特化祖细胞造血生成的时长可以作为实现长期多谱系造血生成的新思路。前期研究表明,Nup98-Hoxa10hd（NA）融合蛋白可以扩增造血干细胞和赋予其移植竞争优势且不引发肿瘤。在本研究中我们想探究NA基因对MPPs和下游的谱系特化祖细胞的影响。方法:通过小鼠基因型鉴定实验,鉴定NALSL/+;Vav-Cre复合型小鼠（NA小鼠）;通过抗体染色和流式分选实验,分选获得多能造血祖细胞（MPPs）,用于移植实验;通过移植实验及受体鼠外周血动...
【文章来源】：广州医科大学广东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NALSL/+品系小鼠构建策略将含元件LSL-Nup98-Hoxa9hd-IRES-Tdtomato的载体通过基因打靶重组到小鼠基因组
广州医科大学硕士学位论文26鼠可通过Tdtomato标记基因经流式分析鉴定（图3.2B）。图3.2NA小鼠基因型鉴定（A）NALSL/+品系小鼠鉴定，目的序列为350bp，纯合子小鼠。图中381#、382#、383#小鼠为所需小鼠。再与Vav-Cre小鼠交配产生NALSL/+；Vav-Cre复合型小鼠。（B）NA小鼠流式鉴定的结果。由于在目的序列后插入了报告基因Tdtomato，故在于Vav-Cre小鼠交配后产生的复合小鼠，通过Cre重组酶切掉了Loxp位点间的序列开启了目的基因的表达，所以通过Tdtomato基因是否表达来鉴定小鼠。注：NALSL/+小鼠由百奥赛图公司构建。我们之前的研究发现在小鼠骨髓HSC中过表达NA，可以在竞争移植中赋予其移植竞争力[55]。为了检测NAMPPs是否能够支持体内长期多谱系造血生成，我们直接取NA小鼠的骨髓细胞进行染色。实验组分选了300个NAMPPs，混合5x105个骨髓细胞（WT，CD45.2），经眼静脉移植到致死剂量辐照受体小鼠体内（图3.3）。同时分选正常小鼠（WT，CD45.1）的MPPs混合5x105个骨髓细胞（WT，CD45.2）做为对照组。在后续的流式分析实验中，Tdtomato+细胞为NAMPPs供体来源的衍生细胞，CD45.1+细胞为WTMPPs供体来源的衍生细胞。
结果27图3.3小鼠移植策略图多能造血祖细胞（MPPs）移植实验。取NALSL/+；Vav-Cre复合型小鼠（CD45.2+，Tdtomato+）和正常小鼠（CD45.1+）的骨髓，直接分选，每个样品分选300个MPPs细胞（Lin-CD48-ckit+Sca1+CD135+CD150-），同时混合5×105个骨髓细胞（CD45.2+，helpercells）进行小鼠眼静脉移植。在移植前，小鼠接受致死剂量辐照（照两次4.75Gy，间隔4h）。（该实验与董勇共同完成）受体小鼠移植后，每个月通过眼球静脉采血方式获取外周血检测供体细胞比率及供体来源细胞谱系比例。移植后流式分析结果显示，移植的300个NAMPPs可以在小鼠体内实现造血重建，长期维持多谱系造血生成，至实验结束时共44周。在第四周时间点，经流式分析显示，NAMPPs实验组供体细胞的起始贡献率是41%；从16周到36周，流式分析结果显示，供体细胞的贡献率上升，维持在60%左右；到第44周，供体细胞贡献率下降到44%；而WTMPPs对照组在第四周检测时的贡献率为35%左右，随后时间点的流式检测，供体细胞的贡献率持续下降，直至第20周，供体细胞的贡献率为0（图3.4A）。我们进一步分析了供体来源细胞的谱系。NAMPPs细胞主要分化为髓系细胞、T细胞和B细胞，分化的B细胞居多（图3.4B；图3.5）。同时，在原代受体鼠中可以观察到非NA供体细胞来源的多谱系血液细胞（图3.6）。综上所述，我们证明了在helper细胞来源及受体鼠来源的HSC竞争的情况下，过表达NA的MPPs移植入原代受体鼠中，可以支持长期多谱系造血生成。
本文编号：3330298
【文章来源】：广州医科大学广东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
NALSL/+品系小鼠构建策略将含元件LSL-Nup98-Hoxa9hd-IRES-Tdtomato的载体通过基因打靶重组到小鼠基因组
广州医科大学硕士学位论文26鼠可通过Tdtomato标记基因经流式分析鉴定（图3.2B）。图3.2NA小鼠基因型鉴定（A）NALSL/+品系小鼠鉴定，目的序列为350bp，纯合子小鼠。图中381#、382#、383#小鼠为所需小鼠。再与Vav-Cre小鼠交配产生NALSL/+；Vav-Cre复合型小鼠。（B）NA小鼠流式鉴定的结果。由于在目的序列后插入了报告基因Tdtomato，故在于Vav-Cre小鼠交配后产生的复合小鼠，通过Cre重组酶切掉了Loxp位点间的序列开启了目的基因的表达，所以通过Tdtomato基因是否表达来鉴定小鼠。注：NALSL/+小鼠由百奥赛图公司构建。我们之前的研究发现在小鼠骨髓HSC中过表达NA，可以在竞争移植中赋予其移植竞争力[55]。为了检测NAMPPs是否能够支持体内长期多谱系造血生成，我们直接取NA小鼠的骨髓细胞进行染色。实验组分选了300个NAMPPs，混合5x105个骨髓细胞（WT，CD45.2），经眼静脉移植到致死剂量辐照受体小鼠体内（图3.3）。同时分选正常小鼠（WT，CD45.1）的MPPs混合5x105个骨髓细胞（WT，CD45.2）做为对照组。在后续的流式分析实验中，Tdtomato+细胞为NAMPPs供体来源的衍生细胞，CD45.1+细胞为WTMPPs供体来源的衍生细胞。
结果27图3.3小鼠移植策略图多能造血祖细胞（MPPs）移植实验。取NALSL/+；Vav-Cre复合型小鼠（CD45.2+，Tdtomato+）和正常小鼠（CD45.1+）的骨髓，直接分选，每个样品分选300个MPPs细胞（Lin-CD48-ckit+Sca1+CD135+CD150-），同时混合5×105个骨髓细胞（CD45.2+，helpercells）进行小鼠眼静脉移植。在移植前，小鼠接受致死剂量辐照（照两次4.75Gy，间隔4h）。（该实验与董勇共同完成）受体小鼠移植后，每个月通过眼球静脉采血方式获取外周血检测供体细胞比率及供体来源细胞谱系比例。移植后流式分析结果显示，移植的300个NAMPPs可以在小鼠体内实现造血重建，长期维持多谱系造血生成，至实验结束时共44周。在第四周时间点，经流式分析显示，NAMPPs实验组供体细胞的起始贡献率是41%；从16周到36周，流式分析结果显示，供体细胞的贡献率上升，维持在60%左右；到第44周，供体细胞贡献率下降到44%；而WTMPPs对照组在第四周检测时的贡献率为35%左右，随后时间点的流式检测，供体细胞的贡献率持续下降，直至第20周，供体细胞的贡献率为0（图3.4A）。我们进一步分析了供体来源细胞的谱系。NAMPPs细胞主要分化为髓系细胞、T细胞和B细胞，分化的B细胞居多（图3.4B；图3.5）。同时，在原代受体鼠中可以观察到非NA供体细胞来源的多谱系血液细胞（图3.6）。综上所述，我们证明了在helper细胞来源及受体鼠来源的HSC竞争的情况下，过表达NA的MPPs移植入原代受体鼠中，可以支持长期多谱系造血生成。
本文编号：3330298
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