Hog1、Slt2-MAP激酶对梨果蜡质及疏水性诱导Alternaria alternata侵染结构分化的调控作用
发布时间：2021-10-05 03:18
促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）级联信号途径对病原真菌生长、形态建成、侵染结构分化、次生代谢、致病性及渗透胁迫响应等多种生理功能具有调节作用,其调控作用因病原物种类、互作系统而异。为进一步阐明Hog1与Slt2-MAP激酶是否参与及如何调控Alternaria alternata响应梨果表皮疏水性和蜡质信号从而启动侵染的过程,本试验在药理学试验的基础上,对梨果致病真菌A.alternata（JT-03）MAPK基因Hog1、Slt2进行鉴定、克隆和生物信息学分析,并构建缺失突变株和回复菌株,从分子水平上系统研究了Hog1和Slt2的生物学功能及对A.alternata响应梨果皮蜡质物化信号进而启动侵染的调控机制,结果如下:1.药理学结果表明MAPK特异性的抑制剂SB203580可显著地抑制梨果蜡质和疏水性诱导的A.alternata孢子萌发及附着胞的形成,同时也减弱了A.alternata对早酥梨的致病能力。2.对Hog1、Slt2-MAP激酶进行基因克隆后分别得到大小为1615bp和1747bp的克隆产物AaHog1和...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
信号传导模式图
Hog1、Slt2-MAP激酶对梨果蜡质及疏水性诱导Alternariaalternata侵染结构分化的调控用19图2同源重组敲除法示意图Fig.2Schematicofhomologousrecombinationknockout表4扩增AaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-up和AaSlt2-down基因所用到引物。Table4PrimersusedforamplicationofAaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-upandAaSlt2-down.GenePrimersequences(5"-3")AaHog1-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGATAGCCGCAGCATACCATTR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCTCCGAGGGATCTTTCTTGTAaHog1-downF:CATGCATGGTTGCCTAACTCGGCGCGCCTTGATGCGGCGGCACAGGAGR:GACGGCCAGTGCCAAGCTTCGGCGCGCCCGGCGGAGGGTAAAGTAGGAAaSlt2-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCAGAAGTGGCGATTGTGGGCR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCAGGAGTCGAGCAGCAGAGAaSlt2-downF:TTGCCTAACTCGGCGCGCCGAAGCTTAGAGCGTGAAGGATTTGGGTAR:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATCACATCAGCAGCGGAGAA2.2.9.1线性化载体的制备构建线性化目的基因敲除载体时所用的载体是pCAMBIA1300（Neo），接下来用Sac-Ⅰ和Xba-Ⅰ分别单酶切载体，酶切体系为150μL：80μLNeo，3μLSac-Ⅰ，3μLXba-Ⅰ，15μL10×buffer，49μLddH20，反应条件为37℃，2h。2.2.9.2上下同源臂与pCHPH的重组反应将上下同源臂的PCR扩增产物与酶切产物经过凝胶电泳检测后进行胶回收，然后根据所得胶回收产物浓度计算目的基因反应体系，体系如下：3μL目的片段，1.5μL线性载体，4μL5×CEⅡbuffer，2μLExnaseⅡ，9.5μLddH20。在37℃反应30min即可完成重组反应，从而实现两线性化DNA的体外环化。2.2.9.3基因敲除载体的转化将重组产物与大肠杆菌感受态DH5α混合后进行转化，步骤同2.2.7.3。
Hog1、Slt2-MAP激酶对梨果蜡质及疏水性诱导Alternariaalternata侵染结构分化的调控用21经过44h后，观察玻璃纸上是否有白色菌丝长出，从长出来的平板上揭下该玻璃纸后将其转移到含有潮霉素B（40μg/mL）和羧苄青霉素钠（500μg/mL）的PDA固体培养基平板上，并继续放在28°C恒温培养箱中进行正常的培养。培养至2~3d后，观察是否有长出转化子。若有转化子出现则将其从玻璃纸上挑取出来，转移到新的PDA固体培养基平板（含潮霉素250μg/mL，羧苄青霉素钠500μg/mL）上培养2~3d。接下来将转化子在含抗生素和不含抗生素的平板上反复交替接种3次，以确保抗性遗传稳定性。2.2.11转化子的筛选及鉴定2.2.11.1基因敲除突变株的PCR鉴定图3转化子验证方法和引物位置示意图.Fig.3Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused表5基因敲除实验中鉴定各突变株所使用的引物序列.Table5TheprimersusedforidentificationofthemutantsofthePCRproductinthegeneknockout.assayGenePrimersequences(5"-3")AaHog1-up-F1TCGGGTGGGTTACAACAGAAAaHog1-down-R1GTCCCTCCTGGTTCTTTAGCAaSlt2-up-F1TCGGAGAAGGAGTCTATGGTGAaSlt2-down-R1CCACATCACTGTTCTGTTACGCTrpCFTAGAGTAGATGCCGACCGGOliCRCTGAAAGCACGAGATTCTTC由于野生型中不存在HPH（olic-Hph-trpc）片段，因此用图3中所示的引物（引物序列如表5所示）不能扩增出相应的条带，而突变株可得到相应大小的条带，因此利用这一差异进行突变株的鉴定。ΔAaHog1与ΔAaSlt2用AaHog1-up-F1/OliC-R和
【参考文献】：
期刊论文
[1]果蔬制品中链格孢霉毒素检测与控制研究进展[J]. 王琦,蔡瑞,王周利,岳田利,崔璐. 食品安全质量检测学报. 2020(01)
[2]白念珠菌Ras/cAMP/PKA途径研究进展[J]. 黄倩,管国波,黄广华,魏羽佳. 菌物研究. 2019(04)
[3]辣椒疫霉MAPK基因家族的鉴定及生物信息学分析[J]. 朱彤彤,杨磊,孙文秀. 生物技术. 2018(05)
[4]采后亚精胺处理对‘早酥梨’黑斑病的控制及贮藏品质的影响[J]. 胡培芳,李永才,马岳岳,毕阳,张婷婷,张彦东. 果树学报. 2018(02)
[5]采后亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制及贮藏品质的影响[J]. 高春丽,李永才,毕阳,刘筱,杨兰,乔文景,王迪,唐瑛. 食品科学. 2016(14)
[6]植物病原真菌致病机理研究进展[J]. 高芬,褚建梅,李静虹,王梦亮. 江苏农业学报. 2014(05)
[7]植物病原真菌中MAPK级联通路研究进展[J]. 彭静静. 江苏农业科学. 2014(09)
[8]玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因组鉴定及途径模型建立[J]. 巩校东,张晓玉,田兰,王星懿,李坡,张盼,王玥,范永山,韩建民,谷守芹,董金皋. 中国农业科学. 2014(09)
[9]稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表达分析[J]. 饶玉春,丁正中,陈析丰,曾大力,马伯军,顾志敏. 中国水稻科学. 2014(01)
[10]MAPK信号通路研究进展[J]. 陈建勇,王聪,王娟,曹礼荣. 中国医药科学. 2011(08)
博士论文
[1]稻瘟病菌G蛋白及MAPK信号途径相关基因的功能分析[D]. 张海峰.南京农业大学 2011
硕士论文
[1]基于苹果梨果皮含量水平的酚类物质对Alternaria alternata侵染及胞外降解酶的调控[D]. 刘筱.甘肃农业大学 2017
[2]发育及贮藏期苹果梨果皮蜡质对Alternaria alternata侵染的影响[D]. 唐瑛.甘肃农业大学 2016
[3]橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析[D]. 孙雅琦.海南大学 2015
[4]灰葡萄孢胞壁降解酶、角质酶及其对番茄植株的致病作用[D]. 吴洁云.扬州大学 2007
本文编号：3418893
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
信号传导模式图
Hog1、Slt2-MAP激酶对梨果蜡质及疏水性诱导Alternariaalternata侵染结构分化的调控用19图2同源重组敲除法示意图Fig.2Schematicofhomologousrecombinationknockout表4扩增AaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-up和AaSlt2-down基因所用到引物。Table4PrimersusedforamplicationofAaHog1-up,AaHog1-down,AaSlt2-upandAaSlt2-down.GenePrimersequences(5"-3")AaHog1-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGATAGCCGCAGCATACCATTR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCTCCGAGGGATCTTTCTTGTAaHog1-downF:CATGCATGGTTGCCTAACTCGGCGCGCCTTGATGCGGCGGCACAGGAGR:GACGGCCAGTGCCAAGCTTCGGCGCGCCCGGCGGAGGGTAAAGTAGGAAaSlt2-upF:ACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCAGAAGTGGCGATTGTGGGCR:GATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGCAGGAGTCGAGCAGCAGAGAaSlt2-downF:TTGCCTAACTCGGCGCGCCGAAGCTTAGAGCGTGAAGGATTTGGGTAR:GTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATCACATCAGCAGCGGAGAA2.2.9.1线性化载体的制备构建线性化目的基因敲除载体时所用的载体是pCAMBIA1300（Neo），接下来用Sac-Ⅰ和Xba-Ⅰ分别单酶切载体，酶切体系为150μL：80μLNeo，3μLSac-Ⅰ，3μLXba-Ⅰ，15μL10×buffer，49μLddH20，反应条件为37℃，2h。2.2.9.2上下同源臂与pCHPH的重组反应将上下同源臂的PCR扩增产物与酶切产物经过凝胶电泳检测后进行胶回收，然后根据所得胶回收产物浓度计算目的基因反应体系，体系如下：3μL目的片段，1.5μL线性载体，4μL5×CEⅡbuffer，2μLExnaseⅡ，9.5μLddH20。在37℃反应30min即可完成重组反应，从而实现两线性化DNA的体外环化。2.2.9.3基因敲除载体的转化将重组产物与大肠杆菌感受态DH5α混合后进行转化，步骤同2.2.7.3。
Hog1、Slt2-MAP激酶对梨果蜡质及疏水性诱导Alternariaalternata侵染结构分化的调控用21经过44h后，观察玻璃纸上是否有白色菌丝长出，从长出来的平板上揭下该玻璃纸后将其转移到含有潮霉素B（40μg/mL）和羧苄青霉素钠（500μg/mL）的PDA固体培养基平板上，并继续放在28°C恒温培养箱中进行正常的培养。培养至2~3d后，观察是否有长出转化子。若有转化子出现则将其从玻璃纸上挑取出来，转移到新的PDA固体培养基平板（含潮霉素250μg/mL，羧苄青霉素钠500μg/mL）上培养2~3d。接下来将转化子在含抗生素和不含抗生素的平板上反复交替接种3次，以确保抗性遗传稳定性。2.2.11转化子的筛选及鉴定2.2.11.1基因敲除突变株的PCR鉴定图3转化子验证方法和引物位置示意图.Fig.3Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused表5基因敲除实验中鉴定各突变株所使用的引物序列.Table5TheprimersusedforidentificationofthemutantsofthePCRproductinthegeneknockout.assayGenePrimersequences(5"-3")AaHog1-up-F1TCGGGTGGGTTACAACAGAAAaHog1-down-R1GTCCCTCCTGGTTCTTTAGCAaSlt2-up-F1TCGGAGAAGGAGTCTATGGTGAaSlt2-down-R1CCACATCACTGTTCTGTTACGCTrpCFTAGAGTAGATGCCGACCGGOliCRCTGAAAGCACGAGATTCTTC由于野生型中不存在HPH（olic-Hph-trpc）片段，因此用图3中所示的引物（引物序列如表5所示）不能扩增出相应的条带，而突变株可得到相应大小的条带，因此利用这一差异进行突变株的鉴定。ΔAaHog1与ΔAaSlt2用AaHog1-up-F1/OliC-R和
【参考文献】：
期刊论文
[1]果蔬制品中链格孢霉毒素检测与控制研究进展[J]. 王琦,蔡瑞,王周利,岳田利,崔璐. 食品安全质量检测学报. 2020(01)
[2]白念珠菌Ras/cAMP/PKA途径研究进展[J]. 黄倩,管国波,黄广华,魏羽佳. 菌物研究. 2019(04)
[3]辣椒疫霉MAPK基因家族的鉴定及生物信息学分析[J]. 朱彤彤,杨磊,孙文秀. 生物技术. 2018(05)
[4]采后亚精胺处理对‘早酥梨’黑斑病的控制及贮藏品质的影响[J]. 胡培芳,李永才,马岳岳,毕阳,张婷婷,张彦东. 果树学报. 2018(02)
[5]采后亚硒酸钠处理对杏果黑斑病的控制及贮藏品质的影响[J]. 高春丽,李永才,毕阳,刘筱,杨兰,乔文景,王迪,唐瑛. 食品科学. 2016(14)
[6]植物病原真菌致病机理研究进展[J]. 高芬,褚建梅,李静虹,王梦亮. 江苏农业学报. 2014(05)
[7]植物病原真菌中MAPK级联通路研究进展[J]. 彭静静. 江苏农业科学. 2014(09)
[8]玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因组鉴定及途径模型建立[J]. 巩校东,张晓玉,田兰,王星懿,李坡,张盼,王玥,范永山,韩建民,谷守芹,董金皋. 中国农业科学. 2014(09)
[9]稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表达分析[J]. 饶玉春,丁正中,陈析丰,曾大力,马伯军,顾志敏. 中国水稻科学. 2014(01)
[10]MAPK信号通路研究进展[J]. 陈建勇,王聪,王娟,曹礼荣. 中国医药科学. 2011(08)
博士论文
[1]稻瘟病菌G蛋白及MAPK信号途径相关基因的功能分析[D]. 张海峰.南京农业大学 2011
硕士论文
[1]基于苹果梨果皮含量水平的酚类物质对Alternaria alternata侵染及胞外降解酶的调控[D]. 刘筱.甘肃农业大学 2017
[2]发育及贮藏期苹果梨果皮蜡质对Alternaria alternata侵染的影响[D]. 唐瑛.甘肃农业大学 2016
[3]橡胶树白粉菌致病相关基因及Mapk途径相关基因的克隆和定量分析[D]. 孙雅琦.海南大学 2015
[4]灰葡萄孢胞壁降解酶、角质酶及其对番茄植株的致病作用[D]. 吴洁云.扬州大学 2007
本文编号：3418893
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