核酸纳米花制备技术的优化及其在炎症发生分子机制分析中的应用
发布时间：2021-12-08 22:47
目的:本研究主要将核酸纳米花（NFs）与RNA激活（RNAa）技术联用在启动子水平上探究miR-155在炎症发生过程中的作用机制以及miR-155与其靶基因共表达后对炎症发生的作用影响,以期实现对重大疾病的早期预警,为炎症的预防、相关疾病的治疗和阻止其恶化提供新思路。方法:1.通过优化连接反应和滚环转录反应的条件、表征NFs的形态大小、检测NFs对细胞的毒性作用、入胞效率和作用效果,构建具RNAa作用的NFs。2.根据saRNA设计原则查找出可激活miR-155的序列、利用CCK-8法检测细胞毒性、RT-qPCR法检测miR-155表达情况从而筛选出可高效激活miR-155的saRNA;随后通过对比细胞形态变化、细胞迁移能力以及炎症相关效应因子表达情况从而证实miR-155在炎症发生过程中的作用机制。3.根据预测的miR-155靶基因及其富集通路,探究激活miR-155及其靶基因后探究二者共表达后相互作用对细胞的影响。结果:1.对NFs的成环过程与扩增过程的反应体系进行优化,选用高连接效率的T4 DNA连接酶、模板与引物浓度比为1:1、将杂交时间优化为2 h和连接时间优化为3 h、原料...
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
miR-155的形成过程
5图1.2miR-155在免疫细胞中的调控作用1.1.4miR-155-SHIP1-PI3K-AKT信号通路对miR-155的靶基因预测我们发现SHIP1是miR-155的靶标，且在SHIP1的3’-UTR中有保守的八聚体靶“种子”，具有高度保守的miR-155结合位点。SHIP1是肌醇5磷酸酶家族的成员之一，主要由造血区室中的细胞表达；其功能是调控造血干细胞的生长、分化和作用发挥。在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中，TNF-α诱导miR-155过表达，随后过表达的miR-155阻断SHIP1，并进一步增强TNF-α的促炎作用[24]。Viernes等[36]研究证明了SHIP1是炎症反应的负调节因子，可通过下调AKT的活性来抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）炎症信号通路的传导途径。PI3K-AKT信号通路是经典的信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡和周期进程和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。其信号过度激活可作用下游多种因子如促进MMP和mTOR的表达、将FOXO和p53磷酸化从而丧失活性、促进血管生成、激活IκB激酶（InhibitorKappaBKinase，IKK）信号体复合物从而激活NF-кB信号通路最终引起miR-155的表达增加。因此，过表达的miR-155靶向SHIP1导致AKT活化延长，从而正反馈炎症信号通路，促使炎症持续进行[37]。综上可知，炎症反应发生后miR-155将过表达并参与炎症反应，过表达的miR-155与炎症反应的发展密切相关，甚至还能诱导癌症发生。然而，这些研究只能证明miR-155过表达后在相关信号通路和免疫细胞的调控中是重要的参与者，在miR-155表达增加的同时，其他相关炎性因子表达也增加。因此，关于miR-155的研究亟需从其源头上加以关注——若无外界炎性物质刺激，仅增加miR-155的表达，是否能引起炎症的发生？
8（8）靶标的3’端具有比其5’端热力学稳定性低。Ago2在saRNA相对于其3"末端的5’末端使用具有较低热力学稳定性的链作为指导。（9）第7个碱基是“T”；第19位碱基是“A”；第18位是“A”或“T”，最好是“A”。RNAa现象早在1969年就被发现[45]，但当时未引起关注，在近10年各位学者才对其重视。RNAa通过激活内源性靶基因的表达来实现的基因功能恢复，可恢复不同基因的功能作用。与传统的基因过表达技术相比，RNAa技术显示出操作简单快捷、实验周期较短、实验成本低等特点，为其用于实验探究提供了诸多优势。由于saRNA在基因调控、表观遗传、疾病治疗等方面具有相当大的应用潜力，鉴于其诸多优势，RNAa可作为一种极有潜力的新型基因干预治疗手段。且Dar研究团队[46]建立了saRNA数据库（http://bioinfo.imtech.res.in/manojk/sarna/）来收集已验证有效的saRNA的详细资料，用以基于基因治疗的研究。因此，RNAa这一技术的研究与应用也提示我们，在源头上探究miR-155在炎症中的作用机制，可通过利用RNAa仅将miR-155的宿主基因激活使其自主形成成熟的miR-155，从而研究其在炎症发生过程中的作用机制，此技术也可大大降低实验技术的难点与减少实验周期。图1.3RNAa的作用过程
【参考文献】：
期刊论文
[1]MicroRNA-155 promotes the pathogenesis of experimental colitis by repressing SHIP-1 expression[J]. Zhan-Jun Lu,Jian-Jiong Wu,Wei-Liang Jiang,Jun-Hua Xiao,Kai-Zhong Tao,Lei Ma,Ping Zheng,Rong Wan,Xing-Peng Wang. World Journal of Gastroenterology. 2017(06)
[2]PI3K/Akt/FoxO3a信号通路对人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞增殖及凋亡的影响[J]. 邱权,叶琳,皮静婷,陈黎黎,陈鸿雁. 第三军医大学学报. 2014(12)
[3]MicroRNA与细胞信号通路的相互作用[J]. 李斌,郭燕华,徐辉,周惠,屈良鹄. 生物化学与生物物理进展. 2013(07)
博士论文
[1]环介导等温扩增及生物分析新方法研究[D]. 杜文芳.湖南大学 2018
硕士论文
[1]基于PLP-RCA的唐氏综合症产前筛查方法的建立与优化[D]. 王倩倩.华侨大学 2019
[2]miR-146a、miR-155-5p在类风湿性关节炎中的作用机制研究[D]. 熊瑶.华侨大学 2019
[3]MiR-155通过靶向结合PI3K/Akt/mTOR信号通路促进ox-LDL诱导的内皮细胞自噬[D]. 殷霜霜.青岛大学 2018
[4]基于适配体的RNAi调控与siRNA递送的研究[D]. 程慧.上海大学 2017
[5]急性髓细胞白血病中miR-155、SHIP1及AKT的表达及临床意义[D]. 胡献丽.南昌大学医学院 2015
[6]DNA自组装纳米花的设计制备与载药及成像应用研究[D]. 梅蕾.湖南大学 2015
本文编号：3529392
【文章来源】：华侨大学福建省
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
miR-155的形成过程
5图1.2miR-155在免疫细胞中的调控作用1.1.4miR-155-SHIP1-PI3K-AKT信号通路对miR-155的靶基因预测我们发现SHIP1是miR-155的靶标，且在SHIP1的3’-UTR中有保守的八聚体靶“种子”，具有高度保守的miR-155结合位点。SHIP1是肌醇5磷酸酶家族的成员之一，主要由造血区室中的细胞表达；其功能是调控造血干细胞的生长、分化和作用发挥。在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中，TNF-α诱导miR-155过表达，随后过表达的miR-155阻断SHIP1，并进一步增强TNF-α的促炎作用[24]。Viernes等[36]研究证明了SHIP1是炎症反应的负调节因子，可通过下调AKT的活性来抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）炎症信号通路的传导途径。PI3K-AKT信号通路是经典的信号转导通路，参与细胞增殖、分化、凋亡和周期进程和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。其信号过度激活可作用下游多种因子如促进MMP和mTOR的表达、将FOXO和p53磷酸化从而丧失活性、促进血管生成、激活IκB激酶（InhibitorKappaBKinase，IKK）信号体复合物从而激活NF-кB信号通路最终引起miR-155的表达增加。因此，过表达的miR-155靶向SHIP1导致AKT活化延长，从而正反馈炎症信号通路，促使炎症持续进行[37]。综上可知，炎症反应发生后miR-155将过表达并参与炎症反应，过表达的miR-155与炎症反应的发展密切相关，甚至还能诱导癌症发生。然而，这些研究只能证明miR-155过表达后在相关信号通路和免疫细胞的调控中是重要的参与者，在miR-155表达增加的同时，其他相关炎性因子表达也增加。因此，关于miR-155的研究亟需从其源头上加以关注——若无外界炎性物质刺激，仅增加miR-155的表达，是否能引起炎症的发生？
8（8）靶标的3’端具有比其5’端热力学稳定性低。Ago2在saRNA相对于其3"末端的5’末端使用具有较低热力学稳定性的链作为指导。（9）第7个碱基是“T”；第19位碱基是“A”；第18位是“A”或“T”，最好是“A”。RNAa现象早在1969年就被发现[45]，但当时未引起关注，在近10年各位学者才对其重视。RNAa通过激活内源性靶基因的表达来实现的基因功能恢复，可恢复不同基因的功能作用。与传统的基因过表达技术相比，RNAa技术显示出操作简单快捷、实验周期较短、实验成本低等特点，为其用于实验探究提供了诸多优势。由于saRNA在基因调控、表观遗传、疾病治疗等方面具有相当大的应用潜力，鉴于其诸多优势，RNAa可作为一种极有潜力的新型基因干预治疗手段。且Dar研究团队[46]建立了saRNA数据库（http://bioinfo.imtech.res.in/manojk/sarna/）来收集已验证有效的saRNA的详细资料，用以基于基因治疗的研究。因此，RNAa这一技术的研究与应用也提示我们，在源头上探究miR-155在炎症中的作用机制，可通过利用RNAa仅将miR-155的宿主基因激活使其自主形成成熟的miR-155，从而研究其在炎症发生过程中的作用机制，此技术也可大大降低实验技术的难点与减少实验周期。图1.3RNAa的作用过程
【参考文献】：
期刊论文
[1]MicroRNA-155 promotes the pathogenesis of experimental colitis by repressing SHIP-1 expression[J]. Zhan-Jun Lu,Jian-Jiong Wu,Wei-Liang Jiang,Jun-Hua Xiao,Kai-Zhong Tao,Lei Ma,Ping Zheng,Rong Wan,Xing-Peng Wang. World Journal of Gastroenterology. 2017(06)
[2]PI3K/Akt/FoxO3a信号通路对人鼻咽癌CNE-1、CNE-2细胞增殖及凋亡的影响[J]. 邱权,叶琳,皮静婷,陈黎黎,陈鸿雁. 第三军医大学学报. 2014(12)
[3]MicroRNA与细胞信号通路的相互作用[J]. 李斌,郭燕华,徐辉,周惠,屈良鹄. 生物化学与生物物理进展. 2013(07)
博士论文
[1]环介导等温扩增及生物分析新方法研究[D]. 杜文芳.湖南大学 2018
硕士论文
[1]基于PLP-RCA的唐氏综合症产前筛查方法的建立与优化[D]. 王倩倩.华侨大学 2019
[2]miR-146a、miR-155-5p在类风湿性关节炎中的作用机制研究[D]. 熊瑶.华侨大学 2019
[3]MiR-155通过靶向结合PI3K/Akt/mTOR信号通路促进ox-LDL诱导的内皮细胞自噬[D]. 殷霜霜.青岛大学 2018
[4]基于适配体的RNAi调控与siRNA递送的研究[D]. 程慧.上海大学 2017
[5]急性髓细胞白血病中miR-155、SHIP1及AKT的表达及临床意义[D]. 胡献丽.南昌大学医学院 2015
[6]DNA自组装纳米花的设计制备与载药及成像应用研究[D]. 梅蕾.湖南大学 2015
本文编号：3529392
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