整合IL-12受体胞内段嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的构建及其功能研究
发布时间：2024-12-29 23:12
目前临床治疗癌症的常用方式包括手术治疗、放射治疗及化学疗法,但这三种方法对于治疗晚期癌症仍收效甚微,因此寻求新的治疗手段迫在眉睫。鉴于嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞在血液瘤治疗上获得了显著的临床疗效,近年来将这一技术应用于实体瘤治疗已逐渐成为研究热点。然而由于肿瘤免疫抑制微环境等多种因素的影响,导致CAR-T细胞在治疗实体瘤过程中的疗效受到限制,因此大量研究致力于对CAR各个结构进行优化,以有效提高CAR-T细胞的抗肿瘤功效。T细胞的活化需要多种信号的参与,包括抗原激活信号（第一信号）、共刺激分子信号（第二信号）及细胞因子信号（第三信号）,但是目前临床使用的CAR-T胞内结构中普遍缺乏细胞因子提供的第三信号,同时在肿瘤微环境中大多为TGF-β、IL-10等抑制信号,因此CAR结构的优化方向之一逐渐集中于为CAR-T细胞提供额外的激活性细胞因子信号。IL-12作为一种Th1型细胞因子,是T细胞活化、分化过程中经典的激活性第三信号,被认为是机体抵抗肿瘤发生、发展的重要效应分子,已逐步尝试应用于CAR-T细胞治疗。目前已经构建能在局部释放IL-12的CAR-T细胞,然而由于IL-12分泌水平...
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 课题背景
1.1.1 癌症治疗现状
1.1.2 CAR-T细胞疗法的现状
1.1.3 CAR-T治疗实体瘤的挑战
1.1.4 CAR结构针对实体瘤的优化
1.1.5 IL-12 的抗肿瘤机制
1.1.6 IL-12 在CAR结构优化的应用
1.1.7 IL-12R及其下游信号
1.2 课题意义及研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞株
2.1.2 慢病毒质粒
2.1.3 常用溶液及配方
2.1.4 实验耗材及试剂
2.1.5 实验主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞实验
2.2.2 构建慢病毒表达载体pCDH-EF1α-CAR-T
2.2.3 慢病毒包装
2.2.4 人外周血单核细胞分离纯化及激活
2.2.5 制备CAR-T细胞
2.2.6 构建PSMA+-Luciferase-PC-3 稳转细胞株
2.2.7 流式细胞术
2.2.8 CAR-T细胞体外抗肿瘤效应
2.2.9 数据统计分析方法
第三章 实验结果与分析
3.1 构建慢病毒表达载体pCDH-EF1α-CAR-T
3.1.1 PSMA/CD19-CAR结构
3.1.2 鉴定重组慢病毒表达载体
3.1.3 小结
3.2 制备PSMA/CD19-CAR-T细胞
3.2.1 慢病毒滴度检测
3.2.2 T细胞中CAR的转导及表达
3.2.3 小结
3.3 构建PSMA+-Luciferase-PC-3 稳转细胞株
3.3.1 PSMA+-Luciferase-PC-3 稳转细胞株的鉴定
3.3.2 小结
3.4 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T活化的影响
3.4.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段CAR-T能诱导蛋白STAT4磷酸化
3.4.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段能促进CAR-T细胞的激活
3.4.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T细胞的增殖无显著影响
3.4.4 小结
3.5 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T分型的影响
3.5.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CD4+/CD8+细胞比例无显著影响
3.5.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段能提高TEM细胞比例
3.5.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T细胞的耗竭无显著影响
3.5.4 小结
3.6 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T效应功能的影响
3.6.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段可促进TNF-α 和IFN-γ 的分泌
3.6.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段可提高CAR-T细胞的杀伤能力
3.6.3 小结
第四章 讨论与展望
参考文献
附录Ⅰ 缩略词表
致谢
本文编号：4021430
【文章页数】：96 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 课题背景
1.1.1 癌症治疗现状
1.1.2 CAR-T细胞疗法的现状
1.1.3 CAR-T治疗实体瘤的挑战
1.1.4 CAR结构针对实体瘤的优化
1.1.5 IL-12 的抗肿瘤机制
1.1.6 IL-12 在CAR结构优化的应用
1.1.7 IL-12R及其下游信号
1.2 课题意义及研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 细胞株
2.1.2 慢病毒质粒
2.1.3 常用溶液及配方
2.1.4 实验耗材及试剂
2.1.5 实验主要仪器
2.2 实验方法
2.2.1 细胞实验
2.2.2 构建慢病毒表达载体pCDH-EF1α-CAR-T
2.2.3 慢病毒包装
2.2.4 人外周血单核细胞分离纯化及激活
2.2.5 制备CAR-T细胞
2.2.6 构建PSMA+-Luciferase-PC-3 稳转细胞株
2.2.7 流式细胞术
2.2.8 CAR-T细胞体外抗肿瘤效应
2.2.9 数据统计分析方法
第三章 实验结果与分析
3.1 构建慢病毒表达载体pCDH-EF1α-CAR-T
3.1.1 PSMA/CD19-CAR结构
3.1.2 鉴定重组慢病毒表达载体
3.1.3 小结
3.2 制备PSMA/CD19-CAR-T细胞
3.2.1 慢病毒滴度检测
3.2.2 T细胞中CAR的转导及表达
3.2.3 小结
3.3 构建PSMA+-Luciferase-PC-3 稳转细胞株
3.3.1 PSMA+-Luciferase-PC-3 稳转细胞株的鉴定
3.3.2 小结
3.4 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T活化的影响
3.4.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段CAR-T能诱导蛋白STAT4磷酸化
3.4.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段能促进CAR-T细胞的激活
3.4.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T细胞的增殖无显著影响
3.4.4 小结
3.5 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T分型的影响
3.5.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CD4+/CD8+细胞比例无显著影响
3.5.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段能提高TEM细胞比例
3.5.3 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T细胞的耗竭无显著影响
3.5.4 小结
3.6 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段对CAR-T效应功能的影响
3.6.1 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段可促进TNF-α 和IFN-γ 的分泌
3.6.2 整合IL12Rβ1 或IL12Rβ2 胞内段可提高CAR-T细胞的杀伤能力
3.6.3 小结
第四章 讨论与展望
参考文献
附录Ⅰ 缩略词表
致谢
本文编号：4021430
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