角蛋白8参与原发性胆汁性肝硬化胆管上皮细胞凋亡、线粒体损伤及其信号传导机制

发布时间：2017-07-05 13:28

  本文关键词：角蛋白8参与原发性胆汁性肝硬化胆管上皮细胞凋亡、线粒体损伤及其信号传导机制

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【摘要】：原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)是一种以肝内中小胆管进行性破坏为特征的自身免疫性胆汁淤积性肝脏疾病。约90%-95%的PBC患者可检测到抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial antibodies,AMA),线粒体何种成分失去免疫耐受引起PBC发病并不清楚。细胞凋亡时细胞膜损伤、卷曲以及外翻使细胞内容物外漏,线粒体成分降解清除障碍,产生免疫原性片段可能诱发了PBC。角蛋白(Cytokeratin,CK)是细胞骨架蛋白中间丝家族中数量最多和最重要的成员,不仅具有保护细胞、维持线粒体正常结构的功能,而且参与细胞生长、凋亡等重要生理病理过程。角蛋白缺失或异常表达与疾病密切相关。研究表明,过表达CK8会引发小鼠慢性胰腺炎;CK8-/-的小鼠会发生自发性结肠炎;乳腺癌中CK8的表达明显上调。近年来,有学者认为CK8缺失或表达异常同肝脏疾病发病相关。研究发现,小鼠肝脏损伤时,CK8以及CK18 m RNA和蛋白的表达量可升高3倍[8,29]。CK8-/-小鼠可出现慢性肝炎,肝细胞损伤、凋亡[30],C57/B1 CK8-/-小鼠约94%胚胎期死亡并伴广泛肝出血、肝损伤[31],FVB/N CK8-/-小鼠55%有正常的生存期,但在基础状态时表现为轻微肝炎、肝巨噬细胞异常和肝细胞增生,予胶原酶灌注后出现明显肝坏死,对凋亡诱导剂的敏感性明显增加[9]。另外有研究报道,CK8表达异常可能同PBC发病相关。PBC患者体内可检测到抗CK8自身抗体,PBC患者肝脏CK8/CK18的蛋白含量可升高2-4倍。国外研究也证实在PBC患者中CK8突变明显升高,CK8缺失或表达异常与PBC的严重程度相关。动物实验亦发现CK8-/-小鼠肝细胞线粒体形态、功能发生变化,且血清抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial antibodies,AMA)阳性。以上研究提示:CK8缺失或异常表达可能参与PBC的发病,但是,CK8缺失或表达异常在PBC发病中扮演的角色并不清楚。本研究探讨CK8是否通过影响线粒体功能诱导细胞凋亡参与PBC发病。【目的】1、研究过表达以及干扰CK8对人胆管细胞RBE凋亡的影响;2、研究过表达以及干扰CK8对人胆管细胞RBE线粒体形态和功能的影响;3、探讨CK8表达异常通过何种信号通路介导细胞凋亡。【方法】1、构建CK8过表达以及干扰慢病毒载体,感染人胆管细胞RBE,建立CK8过表达以及干扰细胞系,采用RT-PCR和Western Blot检测人胆管细胞RBE中CK8的表达量;2、采用免疫细胞化学实验和流式细胞术分析过表达以及干扰CK8人胆管细胞RBE凋亡水平变化;3、采用免疫细胞化学实验和流式细胞术分析过表达以及干扰CK8人胆管细胞RBE线粒体的形态和功能的变化;4、通过Western Blot实验研究AKT信号通路在过表达以及干扰CK8凋亡中作用;5、采用免疫细胞化学实验和流式细胞术分析GCDC作用对人胆管细胞RBE凋亡的影响;6、采用免疫细胞化学和流式细胞术分析GCDC作用对线粒体的形态和功能的变化;7、通过Western Blot实验研究AKT信号通路在GCDC作用后CK8表达异常的人胆管细胞RBE凋亡中作用;【结果】1、CK8表达异常促进人胆管细胞RBE凋亡RT-PCR和Western Blot实验结果显示,过表达以及干扰CK8细胞角蛋白量发生相应改变。激光共聚焦实验结果显示,过表达以及干扰CK8细胞角蛋白成团状、且分布不均,细胞核固缩、碎裂。流式细胞术实验结果显示,过表达以及干扰CK8细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义。2、CK8表达异常参与人胆管细胞RBE线粒体形态和功能变化激光共聚焦实验结果显示,过表达以及干扰CK8细胞线粒体丝状断裂,分布不均。流式细胞术实验结果显示,过表达以及干扰CK8细胞的活性氧含量明显升高,差异有统计学意义。3、CK8表达异常介导人胆管细胞RBE AKT信号通路引起细胞凋亡Western Blot结果显示过表达或干扰CK8细胞AKT的磷酸化蛋白水平明显下调,总蛋白水平无明显变化;AKT下游的抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达明显下调,抗凋亡蛋白Cleaved caspase-3明显上调。4、GCDC促进CK8表达异常人胆管细胞RBE角蛋白破坏、线粒体损伤以及细胞凋亡激光共聚焦实验结果显示,GCDC作用细胞角蛋白成团状、且分布不均,细胞核固缩、碎裂,细胞线粒体丝状断裂,分布不均。流式细胞术实验结果显示,GCDC作用细胞凋亡率明显升高,细胞的活性氧含量明显升高,差异有统计学意义,且在1mM时凋亡最明显。【结论】CK8表达异常促进人胆管细胞RBE凋亡,参与线粒体形态和功能变化,可能部分介导AKT信号通路引起细胞凋亡;GCDC促进CK8表达异常人胆管细胞RBE角蛋白破坏、线粒体损伤以及细胞凋亡,且具有浓度依赖性。
【关键词】：角蛋白8 原发性胆汁性肝硬化 人胆管细胞 线粒体 凋亡
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-21
• 第一部分 慢病毒载体感染人胆管细胞系的建立21-30
• 1 材料21-23
• 1.1 细胞系21
• 1.2 质粒和慢病毒21-22
• 1.3 主要实验试剂22-23
• 1.4 主要实验仪器23
• 2 方法23-27
• 2.1 慢病毒载体的构建23-24
• 2.2 细胞培养24
• 2.3 慢病毒感染细胞24-25
• 2.4 细胞总RNA提取以及定量25
• 2.5 荧光实时定量PCR25-26
• 2.5.1 mRNA反转录25
• 2.5.2 RT-PCR25-26
• 2.6 Western Blot26-27
• 2.6.1 细胞总蛋白的制备26
• 2.6.2 SDS-PAGE26
• 2.6.3 Western Blot26-27
• 2.7 统计学处理27
• 3 结果27-28
• 4 讨论28-30
• 第二部分 角蛋白8表达量异常与人胆管上皮细胞凋亡之间的关系30-41
• 1 材料和仪器30-31
• 1.1 细胞系30
• 1.2 主要试剂30-31
• 1.3 主要实验仪器31
• 2 方法31-34
• 2.1 细胞培养31
• 2.2 慢病毒感染细胞31-32
• 2.3 激光共聚焦显微镜观察角蛋白以及细胞核形态32
• 2.4 激光共聚焦显微镜观察活细胞线粒体形态变化32
• 2.5 流式细胞仪检测细胞内ROS含量32-33
• 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡33
• 2.7 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达33-34
• 2.8 统计学处理34
• 3 结果34-38
• 3.1 过表达以及干扰CK8细胞角蛋白形态发生变化34
• 3.2 过表达及干扰CK8与细胞的凋亡正相关34-36
• 3.3 过表达及干扰CK8后线粒体的形态和功能的变化36-37
• 3.4 过表达及干扰CK8后细胞凋亡相关蛋白以及凋亡相关信号通路蛋白的变化37-38
• 4 讨论38-41
• 第三部分 胆汁酸盐促进角蛋白8表达异常的人胆管上皮细胞凋亡41-54
• 1 材料和仪器41-43
• 1.1 细胞株41
• 1.2 主要试剂41-42
• 1.3 主要实验仪器42-43
• 2 方法43-45
• 2.1 细胞培养43
• 2.2 慢病毒感染细胞43
• 2.3 激光共聚焦显微镜观察角蛋白以及细胞核形态43-44
• 2.4 激光共聚焦显微镜观察活细胞中线粒体形态的动态变化44
• 2.5 流式细胞仪检测细胞内ROS的含量44
• 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡44-45
• 2.7 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达45
• 2.8 统计学处理45
• 3 结果45-50
• 3.1 胆汁酸盐促进过表达以及干扰CK8慢病毒载体感染的RBE细胞凋亡45-47
• 3.2 胆汁酸盐促进过表达及干扰CK8后细胞线粒体损伤47-49
• 3.3 GCDC作用过表达及干扰CK8后细胞凋亡相关蛋白以及凋亡相关信号通路蛋白的变化49-50
• 4 讨论50-54
• 小结54-55
• 参考文献55-62
• 附录62-63
• 个人简历和研究成果63-64
• 致谢64

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本文编号：522200